Transformation bactérienne.

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(THÈSE PRÉSENTÉE A LA FACULTÉ DES SCIENCES DE L’UNIVERSITÉ DE MONCTON POUR L'OBTENTION DU GRADE DE MAÎTRISE ES SCIENCES (M. SC.) PAR NICOLE THÉRÈSE LIRETTE, B. Sc. UNIVERSITÉ DE MONCTON 1999)

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But:

Le but de ce TP d’effectuer une transformation bactérienne d’E. coli (DH10B) suivie la préparation de bactéries compétentes. Pour cela on insère du plasmide pBluescript un fragment de restriction contenant ces bactéries. Pour faire pénétrer ces plasmides dans les bactéries, il faut rendre artificiellement les bactéries « compétentes » c'est-à-dire aptes à laisser pénétrer de l’ADN plasmidique. Après l’intégration du plasmide, les bactéries peuvent résister à l’ampicilline et continuent à croître.

Préparation des bactéries compétentes :

Afin de faciliter la pénétration des molécules d’ADN au travers de la paroi et de la membrane plasmique, les bactéries en phase exponentielle de croissance sont « fragilisées ». Ces bactéries compétentes préparées sont mises en contact avec la solution de plasmides à intégrer. Puis la membrane plasmique est momentanément rendue perméable (formation transitoire de micropores) soit par un choc thermique, soit par un choc électrique. Les bactéries sont alors mises en culture sur un milieu gélosé contenant l’antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le plasmide. Par l’application de cet agent sélectif, seules les bactéries ayant intégré un plasmide peuvent se développer Le plasmide recombinant va alors se multiplier dans la cellule, amplifiant par la même occasion la séquence d’ADN clonée. Lorsqu’une bactérie est transformée par un plasmide, elle se développe sur un milieu gélosé en formant une colonie. Chaque colonie correspond à un ensemble de bactéries identiques provenant de la division d’une seule bactérie. Le maintient du plasmide dans la bactérie recombinante est assuré par la pression de sélection exercée par la présence de l’antibiotique dans le milieu de culture. (Principes des techniques de biologie moléculaire: 2e édition, revue et augmentée)

Les gènes bactériens ne peuvent également passer d’une cellule à l’autre sous forme d’ADN pur. Le processus par lequel une bactérie absorbe de l’ADN pur de son environnement et intègre de façon fonctionnelle cet AND exogène dans son propre matériel génétique est appelé transformation. Ici, on utilise les bactéries E. Coli, qui ne semblent pas avoir élaboré ou retenu, au cours de l’évolution, des systèmes leur permettant incorporer de l’ADN de cette façon. Il existe maintenant, ce pendant, un moyen puissant pour introduire « artificiellement » un ADN fonctionnnel. On découvrit que l’ADN ajouté en présence de quantités élevées de Ca2+ avait un pouvoir de transformation. Cette transformation artificielle induite par Ca2+ n’est efficace chez E.Coli que lorsque l’ADN ajouté est sous la forme d’un réplicon complet capable d’auto-réplication. Les ADN de plasmides et les chromosomes viraux intacts ont une grande efficacité de transformation, alors que les fragments linéaires d’ADN bactérien n’opèrent de transformation qu’à un niveau beaucoup plus faible. On estime que le fait que ‘ADN linéaire ne transforme pas de façon efficace provient ce de qu’il est dirigé par les DNases périplamiques avant d’être conduit jusqu’au cytosol. Les souches d’E.Coli manquantes de ces nucléases sont transformées par des fragments exogènes d’ADN avec beaucoup plus d’efficacités. Le fait que le traitement au Ca2+ permet de transformer pratiquement toutes les espèces bactériennes a eu des conséquences très importantes. On peut en effet introduire n’importe quel morceau d’ADN, après insertion dans un plasmide adéquat, dans n’importe quel génome bactérien. Ainsi la transformation bactérienne, qui révéla d’abord au monde scientifique autre moyen beaucoup plus maniable que l’infection virale pour spécifique dans une cellule. (Smith, H.O, D.B Danner et R.A Deich. 1981. « Genetic Transformation » Ann.Rev.Biochem. ; 50 : 41-68 et Raiband, O., M.Mock et M.Schwartz. 1984. A technique for Intergrating Any DNA Fragment in to the Chromosome of E.Coli. Gene, 29 : 231-241)

Méthode :

Une pré-culture de la souche bactérienne d’intérêt est mise en culture dans 20 mL de TYM pour garantir une meilleure compétence, la colonie utilisée pour inocculer la culture doit être fraîche. Le lendemain, diluer la préculture dans 600 mL de TYM préchauffé, sans antibiotique pour garantir une croissance optimale des bactéries. Agiter vigoureusement jusqu’à une DO600=0.6. A la DO désirée, répartir la culture dans des flacons 50 mL et centrifuger à 4°C (vitesse maximale, 10 min). A partir de cette étape toutes les opérations doivent être menées à 4°C, en utilisant des tubes et solutions refroidies à 4°C au préalable, pour garantir une compétence maximale. Resuspendre le culot dans 5 mL de. Conserver la suspension cellulaire sur glace pendant 1 h., puis centrifuger dans 8 minutes. Resuspendre très précautionneusement le culot résultant dans 2 mL de TBFII. Aliquoter la suspension cellulaire par 100 μL pour 8 aliquots et 500 μL pour 2 aliquots . Les aliquots sont immédiatement plongés dans un bain de galce sèche - éthanol et stockés ensuite à -80°C. Une telle préparation donne typiquement des bactéries compétentes avec une efficacité de transformation de 104 à 106 transformants/μg d’ADN/aliquot.

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Matériel biogique :

- Une souche de bactéries E.Coli DH10B

- Solutions/milieux de cultures : Milieu TYM , TFBI (30mM acétate de K, 50mM MnCl2, 100 mM KCl , 10 mM CaCl2, 15% Glycérol) et TFBII (10mM pH 7 Na-MOPS, 75mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% Glycérol)

Matériel :

- Bain-marie

- Glace

- Centrifugeuse

- Vortex

- Bec bunsen

- Tube de centrifugation plastique à bouchon, vissant et stérile

- Pipettes

- Tubes Eppendorf

Transformation :

Matériel :

- Bain-marie

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