Amplification sélective in vitro : PCR

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équivalents

⁃ Pas de structure secondaire surtout à l’extrémité 3’

• Le tampon

Tris-HCl ph 8,3 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM

• Les dXTPs

Concentration saturante (20 µM)

1. Les problèmes liés à la méthode

• Problème majeur : la contamination

→ manipuler l’ADN amplifié dans une pièce spéciale ou sous une hotte (hotte PCR : petite enceinte sous UV qui cassent l’ADN contaminant)

→ travailler avec des cônes à filtre (pour que la pipette ne soit pas contaminée par ce que l’on prélève)

• Le manque de fidélité de la Taq

→ utiliser les nouvelles polymérases Vent® ou Pwo®

• L’amplification parasite

À la température initiale (25°C), la Taq peut s’hybrider un peu n’importe où, et commence à faire les élongations de ces amorces. On a donc le temps de faire une première amplification non spécifique.

→ Solution la plus évidente : mettre la Taq seulement lorsque l’on a atteint la température de dénaturation.

→ Autres solutions :

Hot start avec la Taq Start anticorps® ou une barrière huileuse

Toujours faire un témoin avec de l’eau (à la place de l’ADN) : dans ce tube on ne doit avoir aucune amplification. Si on observe une amplification, c’est qu’il y a eu contamination.

1. Clonages des fragments amplifiés

La Taq polymérase rajoute un A de façon non spécifique côté 3’. Cette base non appariée peut servir à faire le clonage.

→ Les plasmides T ont été créés pour réaliser le clonage.

Le clonage en bouts francs est aussi possible avec d’autres polymérases qui ne rajoutent pas de A.

On peut créer les sites de restriction que l’on veut aux extrémités des fragments de PCR : on les inclut dans l’amorce qui va servir à la PCR. Le fragment amplifié contiendra les nucléotides ajoutés aux amorces.

Détermination de la séquence d’un acide nucléique

→ TD sur les techniques de séquençage. (ddXTP)

Analyse de l’expression des gènes

→ ARNm.

2 types d’analyses : qualitative (présence/ absence) et quantitative (comparaison du niveau d’expression).

1. Analyse qualitative

• Northern Blot

Migration des ARN (même technique que dans le Southern Blot avec de l’ARN au lieu de l’ADN).

1ère étape : extraire les ARN.

Pas besoin de digérer les ARN car ils ont une taille qui permet de les séparer sur gel (et on a pas les enzymes nécessaires à la digestion)

2ème étape : migration sur électrophorèse en gel d’agarose en conditions dénaturantes (car on veut séparer les fragments en fonction de la taille, et on doit donc rendre la pelote d’ADN linéaire) : rajout de formamide dans le gel d’agarose. Permet d’éliminer les liaisons H entre les bases et de linéariser l’ARN.

On peut mettre un standard de poids moléculaire d’ARN.

3ème étape : étape de transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose.

4ème étape : Pré-hybridation dans tampon riche en sel, hybridation avec une ribo-sonde qui reconnaît l’ARN recherché, lavages, révélation de la sonde.

On peut déterminer :

⁃ l’absence ou la présence de l’ARN : si on a un signal, l’ARN est présent, donc le gène correspondant est présent ; si on n’a pas de signal, l’ARN n’est pas présent et le gène n’est donc pas présent dans la cellule.

⁃ la taille de l’ARN (grâce au standard de poids moléculaire).

⁃ s’il y a eu un épissage alternatif si on a différentes tailles de fragments.