Purification du lysosyme du blanc d'oeuf
Par Raze • 21 Mai 2018 • 2 174 Mots (9 Pages) • 1 003 Vues
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[pic 7]
Etant donné que nous avons les mêmes concentrations pour les deux solutions mères, VNaCl = VTris-HCl = 25 mL.
On complète notre tampon avec 200mL d’eau pour avoir 250mL demandés
Tampon d’élution :
Pour préparer 40mL de tampon (tampon carbonate 0,2M pH 10,5) à partir de solutions de carbonate de sodium (Na2CO3) 0,2M et de bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,2M, on devra calculer les volumes nécessaires sachant que le pKa du couple acide base est de 10,5 :
On sait que [NaHCO3]f + [Na2CO3]f = 0,2M et que [pic 8]
On résout alors l’équation à 2 inconnues :
[NaHCO3]f = 0,2 – [Na2CO3]f et = 10pH – pKa = 1,58[pic 9]
⬄ (0,2 - [Na2CO3]f) x 1,58 = [Na2CO3]f
⬄ [Na2CO3]f= 25mL et [NaHCO3] = 15mL
Préparation de l’extrait de blanc d’œuf :
On veut diluer 10 fois 5mL du filtrat de blanc d’œuf prélevé au préalable sachant que :
Facteur de dilution = 10 ⬄ ⬄ Vf = F x Vm = 5 x 10 = 50 mL[pic 10]
Donc on va ajouter aux 5mL, 45 mL de tampon d’équilibration pour obtenir notre fraction 1 (F1).
Préparation des autres fractions :
On obtient les fractions 2 à 5 en récupérant le surnageant après chaque centrifugation.
Suite à l’introduction du tampon d’élution dans notre colonne à chromatographie, on collecte les fractions E1 à E6.
MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DU LYSOZYME
Avant de mesurer l’activité des différentes fractions, il convient de tester dans quelles limites l’activité mesurée est proportionnelle à la quantité d’enzyme ajoutée.
Ainsi, à partir d’une solution de lysozyme commercial, on va effectuer une série de mesures avec des prises d’essais de solution d’enzyme.
Tableau 1 : gamme étalon de lysozyme commercial
Tubes
1
3
3
4
5
6
Substrat (en µL)
1900
1900
1900
1900
1900
1900
NaCl 0,15M (en µL)
1075
1050
1025
1000
950
900
Enzyme (en µL)
25
50
75
100
150
200
∆A/min
0,0404
0,0632
0,0926
0,1167
0,1563
0,1629
Activité enzymatique (AE) en UE
40,4
63,2
92,6
116,7
156,3
162,9
Substrat : suspension de membranes à 0,3mg/mL dans le tampon phosphate 0,1M pH=7
Calcul de l’activité enzymatique
AE = ∆A x 1000 en Unité Enzymatique.
Exemple de calcul pour le tube 1 :
AE1 = ∆A1 x 1000 = 0,0404 x 1000 = 40,4 UE
On peut tracer une droite (nombre d’unités enzymatique en fonction de la quantité d’enzyme à partir de nos valeurs (Annexe 1).
On détermine alors dans quelles limites l’activité mesurée est proportionnelle à la quantité d’enzyme ajoutée : notre droite n’est plus proportionnelle à partir de 163 UE. L’activité des fractions qu’on analysera devra être dans la gamme étalon, pour une valeur hors gamme, on devra faire une dilution
On peut maintenant mesurer l’activité des différentes fractions en tenant compte de la limite.
Tableau 2 : Mesure de l’activité enzymatique des fractions 1 à 5 et E1 à E6
Tubes
F1
F2
F3
F4
F5
E1
E2
E3
E3’
E4
E5
E6
Substrat
(en µL)
1900
1900
1900
1900
1900
1900
1900
...