Purification et analyse

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4 Modes de transfert :

Porosité (um)

Substances retenues

MF = Microfiltration

0.1

Particules, bactéries

UF = Ultrafiltration

0.01

Macromolécules (protéines, virus…)

NF = Nanofiltration

0.001

Ions, sucres

OI = Osmose inverse

Ions monovalents, sels, laisse passé l’eau

[pic 4]

Principe : Consiste à séparer les molécules solides qui se trouvent en suspension dans un liquide.

- Types de filtres :

En profondeur : (savoir définir)

- Nature : substances fibreuses (coton, cellulose) ou agglomérés (verre, sable) qui crée un réseau de canaux à l'intérieur deu filtre, réseau dans lequel viennent se bloquer les substances arrêtées par la filtration. - Capacité de filtration : augmente avec l'épaisseur mais diminue qd la préssion exercées sur le filtre augmente.

En Ecran : (savoir définir)

- Nature : cellulose - Retiennent les particules dont la taille est sup à celles des pores du filtre. - filtration stérilisante, utilisé en cytologie

- Procédés de filtration : (à retenir)

Filtration par gravité

Filtration sous vide

- Matériel :cf shéma

- Bécher-filtre-entonnoir (par gravité) - Filtration sur Büchner (sous vide) - Filtration sur verre fritté.

L'ULTRAFILTRATION

- Procédé de séparation des molécules dissoutes en fonction de leur poid moléculaire PM. Adaptés aux protéines.

- Fait appel à des membranes à perméabilité sélective, substance de taille inférieur à celle des pores passent ainsi que solvant et supérieures sont retenues.

Il y a alimentation de la membrane (par le perméat retenu par la membrane (comme le dialysat dans la dialyse) et le rétentat est éliminé car non retenu par cette membrane ???????????????. (cf représentation schématique d'u procédé de séparation membranaire)

[pic 5]

Le seuil de coupure est la valeur de PM pour laquelle on à 99% de rétention, la membrane doit avoir un seuil de coupure dessous par exemple 25 kDa si la protéine est de de 25 kDa. Le choix de la membrane dépend donc de la protéine que l'on veut étudier.

- Facteurs déterminants dans la rétention d'un soluté :

- Caractéristiques de la mb (seuil de coupure, charge de surface, hydrophobicité) - Caractéristiques du soluté (masse moléculaire, taille, forme, pK, charge, hydratation, hydrophobicité) - Autres espèces chimiques présentes dans l'eau (force ionique, pH, agents complexant)

- Principe de Base :

La séparation augmente quand :

- L'affinitié du soluté pour la mb est faible - Taille et masse molaire du soluté imp

Par le phénomène du passage des molécules dissoutes au travers de la membrane il y a phénomène d'accumulation du soluté à la surface de la membrane, c'est le phénomène de polarisation de concentration, conduit à de la précipitation, c'est le colmatage du filtre, il ne peut plus rien laisser passer. Donc on utilise des modes de filtration différents. On fait de la filtration Tangentielle, en appliquant un courant (préssion) lors du passage des molécules et permet le contrôle de la polarisation.[pic 6]

dialyse : gradient de concentration, filtration : préssion

[pic 7]

III. Centrifugation et ultracentrifugation

- Principe :

-Séparation des particules sous l'action d'un champ de gravitation - Technique préparative - Après centrifugation, la partie située dans le fond du tube est appelé culot de centrifugation et la partie supérieure est le surnageant.

(Les macromolécules ne sédimentent pas seules car sont agitées naturellement par le mvt brownien.)

- Lorsque les particules en suspension dans leurs solvants sont soumises à une force centrifuge, l'accélération générée pousse les particules vers le fond du tube.

La vitesse à laquelle se déplacent les particules est proportionnelle à :

-la force gravitationnelle à laquelle les particules sont soumises - la masse des particules - la différence entre la densité des particules et le solvant

En revanche la vitesse de déplacement des dits partiucles est inversement proportionnelle à leur friction dans le milieu, elle-même fonction de la taille et de la géométrie des particules.

- Matériel de centrifugation :

- Un moteur capable de tourner à pslrs dizaines de milliers de tour par min. - Un rotor capable de supporter de telles vitesses. 2 types : à angle fixe et à godet oscillant - Une enceinte réfrigérée sous vide et blindée.

- La force centrifuge :

La force centrifuge relative (FCR) est exprimée en multiple de l'accélération terrestre (nb de fois de l'accélération terrestre).

FCR (g) = 1,12 x r x n2 r = rayon en mm n = nb de tours par min/1000

- Suivant le rapport de densité entre les molécules à séparer et le solvant dans lequel elles se trouvent, 2 principes de centrifugation :

- Centrifugation en gradient de densité

- Basée sur des différences de vitesse de