Cr Préparation et analyse de la Caséine

...

Pour réaliser le dosage par colorimétrie, on va utiliser le réactif de Folin qui en milieu alcalin est réduit par le noyau phénolique des résidus de caséine qui va donner une couleur bleue une fois la réaction réalisée.

On réalise une gamme de concentration de 0 à 50 mg/L de Tyrosine dans un volume final de 1mL. Puis on réalise également deux tubes, un de solution mère d'hydrolysat de caséine et un autre de solution diluée au ½ en utilisant la solution d'HCl à 0,2 mol/L, les deux solutions ont un volume final de 1mL.

On prend 500µL de chacune des solutions préparées précédemment, puis on y ajoute à chacune 2,5 mL de NaOH à 0,2mol/L et 0,25mL de réactif de Folin.

On réalise les mesures de l'absorbance à 750nm de chacune des solutions précédentes à l'aide d'un spectrophotomètre, en effectuant préalablement l'étalonnage du spectrophotomètre grâce à la solution témoin (T) d'HCl à 0,2mol/L à laquelle le réactif de Folin a été rajouté.

- Chromatographie sur couche mince

On effectue une CCM afin de connaître la composition en acides aminées de deux tri-peptides provenant de la solution hydrolysée de la caséine, ici on prendra les mélanges MD1 et MD2. En effet, la CCM est une méthode pour séparer des molécules basées sur l'affinité de ces molécules pour les phases stationnaire ou mobile.

On a donc ici, la phase stationnaire qui est la phase hydrophile car la couche est de la cellulose qui constitue une phase polaire donc une phase hydrophile. Ainsi, la phase mobile est le butanol qui est un mélange apolaire car il présente une longue chaîne carbonée.

Les acides hydrophobes migreront plus vite donc seront plus haut sur le support et les acides hydrophobes migreront moins vite.

Sur une feuille de cellulose (10x20 cm), on trace au crayon à 2cm du bord une ligne de dépôt que l'on segmente tout les centimètres. Puis à l'aide de capillaire, on place sur les repères tracés au préalable les acides aminés et deux fois des hydrolysats tri-peptides MD1 et MD2.

Sous une hotte aspirante pour éviter les effluves, on met en contact la feuille de cellulose avec la phase mobile, le butanol. Puis le mélange est monté par capillarité, qui est le résultat d'une chromatographie ascendante.

Discussion/Conclusion

1. Précipitation au point isoélectrique

Le rendement d'une personne à l'autre est différent pour différentes raisons :

→ Dosage plus au moins précis selon le matériel utilisé

→ La récupération du précipité n'est pas totale

2. Dosage de la caséine

Nous avons choisi cette courbe d'étalonnage ( Figure 2) car l'autre binôme a effectué un mauvais étalonnage faussant ainsi ses résultats.

Nous avons obtenu une concentration massique de 27,225 g/L pour la caséine, la valeur théorique est de 28 g/L, ce qui nous donne un rendement de 97,2 %, ce qui est satisfaisant. Il n'est pas de 100% car il y a eu des pertes lors de la manipulation.

3. Chromatographie sur couche mince

Nous avons sélectionner cette chromatographie (Figure 1) car lors de l'ouverture d'un microtube plusieurs gouttes se sont éparpillées sur la couche mince de la chromatographie ce qui a empêché la lecture de la chromatographie.

Les résultats théorique pour MD1 sont Asn, Phe, Leu et pour MD2 sont Gln, Ala, Pro.

Nous obtenons pour MD1 Mis au lieu de Asn car le Rf est identique mais on a choisit Mis à cause de la couleur qui était plus ressemblante alors qu'en faite il fallait regarder la taille de la tâche.

Figure 2. Courbe d'étalonnage d'absorbance à 750 nm

Grâce à ce TP, nous avons pu avoir de la caséine pur pour étudier ces effets sur l'organisme lors d'une prochaine expérience.

Références

http://www.produits-laitiers.com/le-comportement-des-consommateurs/