Travaux pratiques Immunologie

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- Bleu de Coomassie

Dans une boite en plastique (spécifique) :

- 50ml de solution de coloration, ici : Acide acétique 10 %, l’Ethanol 50 % ainsi que Bleu de Coomassie 0,25 %

- Y déposer les gels

- Laisser 15 minutes

Décoloration :

- Récupérer le bain de coloration dans le flacon initial

- Rincer la boite sans retirer le gel avec un petit volume d’eau

- Mettre les gels dans le décolorateur rempli de solution de décolaration fournie, ici : Acide acétique 7 % ainsi que l’Ethanol 5 %

- Brancher l’appareil et laisser décolorer 30 min ( Si la coloration n’est pas complète, prolonger l’opération)

Les protéines doivent apparaitre sous forme de bandes Bleue sur fond clair. [pic 1]

- Western Blot

On transfert les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose, pour cela :

- On découpe la membrane de nitrocellulose

- On trempe la membrane quelque minutes dans l’éthanol que l’on rinçe dans de l’eau.

- Ensuite on trempe quelques minutes deux éponges ,2 papiers filtres et la membrane de nitrocellulose et le gel dans le tampon de transfert

Nous procédons au Sandwich qui se compose de : L’Eponge, papier, membrane, gel , papier, éponge .

- On le place le sandwich dans la cuve de transfert

- Ensuite nous remplissons la cuve avec du tampon, on branche le générateur et on laisse 1 heure.

Saturation :

Nous sortons la membrane et nous la mettons à tremper dans 5 ml de Tampon de saturation pendant 15 minutes.

Fixation Anticorps :

Nous incubons la membrane dans 5 ml de Tampon de TBS-T contenant l’anticorps anti-DsRed avec une dilution de 1/1000 que nous incubons ensuite pendant 1 heure.

Nous faisons ensuite 3 lavages de 5 minutes avec 5 ml de Tampon TBS-T.

Nous incubons ensuite la membrane avec l’anticorps secondaire anti IgG de chèvre couplé à la phosphatase alcaline dilué au 1/1000 dans du TBS-T, pendant 45 minutes sous agitation.

Nous terminons par faire 3 lavages de 5 minutes avec 5 ml de Tampon TBS-T.

Révélation :

Nous procédons à 1 lavage de 3 minutes avec 5 ml de Tampon phosphate.

Ensuite nous incubons la membrane dans le mélange de révélation contenant du BCIP et du NBT à 0,2 mg/ml dans le Tampon Phosphatase.

Résultats et Discussion

A l’aide de l’annexe 1 on peut définir le poids moléculaire de la DsRedT3 et donc prévoir son poids moléculaire.

Sachant qu’un acide aminé à un poids d’environ 110 Da

Il y a 225 acides aminés dans cette séquence donc 225*110=24 750 Da.Le résultat attendu sera donc d’environ 24 000- 25 000 Da.

Les Résultats attendu de notre gel coloré au Bleu de Coomassie sont :

- Que bleu de coomassie colore toutes les protéines,

- Dans l’induit on doit avoir la DsRed

Dans le Non induit pareil + une bande en plus

Voici les résultats obtenu de notre gel coloré au Bleu de coomassie :

On observe une bande entre les 2 bandes du standard dans l’induit. Cette bande correspond à la DsRed dénaturé.

Mais pour confirmer son poids moléculaire il faut tracer le log du Poids moléculaire en fonction de la distance de migration.

Ici nous n’avons pas besoin de faire le Rf car les protéines ont toutes migrés au même endroit. On fait donc seulement la distance de migration.différence.

Quelle est la différence entre un Western Blot et une coloration au Bleu de Coomassie ?

Le Western Blot met en évidence la protéine DsRed.C’est la plus spécifique car on utilise des anticorps alors que le Bleu de Coomassie montre toutes les protéines des extraits bactériens mais pas de façon spécifique.

Le Western blot permet de confirmer le Bleu de Coomassie.

Conclusion :

Pour conclure on peut dire que l’analyse de la protéine DsRedT3 par electrophorèse sur gel de polyacrylamide après coloration au Bleu de Coomassie et par un western Blot réalisé à l’aide d’un anticorps anti-DsRed après electrotransfert sur membrane de nitrocellulose nous a permis de déterminer son poids moléculaire.