Outils et bases moléculaires - préparation des acides nucléiques

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- élimine seulement les molécules solubles, purification insuffisante à partir de lysats brute.

Extraction au phénol : + inactive toutes les enzymes et élimine toute les protéines . Séparation ADN/ARN selon pH

- Rendement moyen, nécessite d’éliminer les traces de phénol. Toxique

- suivie d’extraction au chloroforme et précipitation

Colonnes échangeuses d’ions ou de silice : + assez rapide

- séparation partielle des différent acides nucléiques, n’élimine pas toute les protéines (calibré pour une gamme de quantité étroite. Ex : midi prep = 20-100 microgramme)

- précipitation pour éliminer les sels

- les agents chaotropiques dénature l’ADN

Gradient de chlorure de césium : + acide nucléiques extrêmement pur. Sépare les ADN circulaires, linéaires et les ARN

- rendement correct si plus de 100 micro gramme d’ADN (ne marche pas pour moins de 20 micro gramme), lent, nécessite du matériel spécialisé.

- précipitation pour éliminer le chlorure de césium, utilisation de bromure d’éthydium.

Quelle quantité d’ADN -> pas apprendre

Analyse des échantillons d’acides nucléiques

- mesure du spectre UV ( A260 absorbance max pour acide nucléiques, A280 : max pour protéine, A320 utilisé pour calibration, pas d’absorbance)

- Calibration du spectrophotomètre avec un « blanc » = sans acide nucléiques

- Eau pure ou tampon dilué (

- Echantillons préparer dans les mêmes conditions.

Electrophorèse en gel d’agarose

Dans ce gel, il y a des pores qui permet au nt de passer. On applique une force pour faire passer les nt. Les acides nucléiques sont ensuite séparés par leur taille.

Visualisation d’une électrophorèse d’ADN colorée au BET

Pas visible a l’œil nu directement -> utilisation d’UV.

Pour détecter un acide nucléique on utilise du bromure d’ethidum : c’est un agentin intercalent flurorochrome. Quand il s’intercale dans la double hélice il provoque des distorsion de l’ADN.

Visualisation d’une électrophorèse d’ADN colorée au BET : protection contre les UV indispensable.

Visualisation d’une électrophorèse d’ADN colorée au SYBRR green : c’est un autre agent intercalent florescent aux UV, en théorie moins toxique.

Variation de la résolution du gel d’agarose : on peut changer le pourcentage d’agarose : il peut varier de 0,5 à2%. Si faible concentration -> bonne visualisation des gros PM et inversement. En général, on utilise 1% d’agarose.

Marqueur de taille et courbe étalon :

On peut avoir une séparation qui est linéaire par rapport au log de la taille. Si on a un fragment de taille inconnu, on peut faire un calcul pour le déterminer.

Exemple d’électrophorèse d’ADN génomique

Non digéré : ils ont migré tous au même endroit

Exemple d’éléctrophorèse : plasmide :

Les plasmides sont circulaire. On trouve différentes forme de plasmide : un correspondant à un cercle : bande à moindre mobilité -> forme relaché : présent en faible quantité.

Forme super enroulé : le plasmide a été tordu sur lui même. Il a la même taille que le précédent, mais ne va pas migrer de la même façon : c’est une bande à + forte mobilité. C’est la présence de l’agent intercalant qui va modifier la distance de migration.

Lorsqu’on analyse un plasmide, on pourra donc avoir plusieurs formes.

Exemple electro d’ARN :

ARN Poly A : contnium de bande qui correspond à des ARNm.

Electrophorèse en champ pulsé :

C’est une électro d’ADN de très fort PM (chromosome entier, grand fragment) :c’est contrôlé de façon électronique.

Les endonucléases de restriction

Ce sont des Ez d’origine bactérienne, nom composé de 3 à 4 lettres.

Les trois types d’enzymes :

- Type I : coupe 1000 à 500 pb après la séquence reconnu

- Type II : coupe au niveau de la séquence reconnue

- Type III : coupe une vingtaine de pb après la séquence reconnue

Le mécanisme de restriction

Ex avec Eco RI : il va reconnaître une séquence palindromique : AATTC : lorsqu’on sépare les 2 brins d’ADN 4 bases qui sont simple brin qui peuvent se réassembler les unes avec les autres. Ces Ez proviennent des bactéries et utilisent ces Ez comme système de défense contre les virus et les ADN d’origine étranger. Ils ont aussi des méthylase qui va rajouter une méthyl sur l’adénine et lorsque l’ADN est méthylé, l’Ez EcoRI n’est pas coupé.

Fréquence de coupure :

Taille du site de restriction :

- 4 => fréquence de coupure : 1 coupure tous les 256 pb

- 6 => 1 coupure tous les 4096 pb

- 8 =>1 coupure tous les 65 476 pb.

Les différents types de coupures

- à bout franc : Ez qui va couper au milieu du site de restriction

- à bout cohésifs : extrémité 5 ‘ sortante : coupure asymétrique

- à bout cohésif : extrémité 3’ sortante

1 U = activité pour digérer A microgramme d’ADN test/h.