Ingénieur en chimie, l'industrie pharmaceutique tunisienne.

...

[pic 3]

Equation 2

(loi de Beer –Lambert)

Avec : I0 = intensité du rayonnement monochromatique incident

I = intensité du rayonnement monochromatique transmis

T = I/I0 :transmittance

En l’absence d’autres facteurs physico-chimique, l’absorbance mesurée (A) est proportionnelle à l’épaisseur (l) de la couche traversée et à la concentration (c) de la substance dissoute, en accord avec l’équation :

[pic 4]

Equation 3

ε : coefficient d’extinction molaire en (mol-1L cm-1)

l : largeur de la couche traversée en (cm)

c : concentration de l’échantillon en (mol L-1)

II.2.2. Fonctionnement d’un spectromètre UV- Vis

Un spectromètre, destiné à l’absorption ou à la transmission de la lumière contient généralement une source lumineuse, des lentilles et des filtres pour guider le trajet lumineux ainsi qu’une partie destinée à la production de longueurs d’ondes données.

Dans un spectromètre UV- Vis, on peut produire à l’aide d’un monochromateur (à réseau ou à prisme) une lumière pratiquement monochromatique aussi bien dans le domaine visible que dans l’UV. La plupart des appareils UV-Vis sont conçus suivant le schéma de principe représenté ci-dessous [10-11].

[pic 5]

Figure II-1: Montage d’un spectromètre UV-Vis

Avec ces appareils, il est possible d’enregistrer les spectres automatiquement. Pour composer l’absorption propre du solvant utilisé, on commencera dans un appareil simple faisceau à ajuster à zéro l’absorption du solvant avant de mesurer l’échantillon. Par contre dans un spectromètre à double faisceau, le rayon lumineux peut être conduit alternativement à travers la cuve de référence (solvant) et la cuve de mesure (l’échantillon), ou bien divisé en faisceau de référence et faisceau de mesure par un disque rotatif.

II.3. La chromatographie en phase liquide

II.3.1. Définition et principe de la méthode

La chromatographie est une technique analytique. Elle permet la séparation d'un ou de plusieurs composés d'un mélange pour leur identification et leur quantification.

Le principe de la technique consiste à séparer les composés d’un mélange. Ce mélange est introduit dans un liquide appelé éluant ou bien phase mobile. La séparation est basée sur l’interaction entre les molécules de ce mélange et une phase introduite dans une colonne, appelée phase stationnaire.

. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt en permanence le système chromatographique. Le mélange de solutés dissous dans un solvant, est injecté par l'intermédiaire d'une vanne, puis transporté à travers le système chromatographique.

Au niveau de la colonne, les composés en solution se répartissent suivant leur affinité, entre la phase mobile et la phase stationnaire.

Le signal enregistré à la sortie d'un détecteur approprié, en fin de colonne, a la forme d'un pic.

La phase stationnaire est un support poreux recouvert d’un gel (liquide greffé) qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés.

La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne.

Si la séparation est bonne, chaque pic représente un constituant du mélange à séparer.

L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme [12].

II.3.2. Polarité et chromatographie

a. Polarité des phases

On utilise la notion de polarité comme un objet comparatif entre molécules. On dit que tel composé est plus polaire ou moins polaire qu'un autre. De même on dit que la phase mobile et la phase stationnaire sont polaires, peu polaires ou apolaires.

Pour que la séparation chromatographique de composés aura lieu, il faut que leurs molécules interagissent de manières différentes avec au moins une des phases (stationnaire et mobile). Ces phases doivent avoir des polarités différentes.

L'ensemble "phase stationnaire polaire et phase mobile peu polaire" forme la chromatographie à polarité de phase normale

L'ensemble "phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire" forme la chromatographie à polarité de phase inversée.

· Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que les composés non polaires.

· Sinon, les composés apolaires seront plus retenus que les composés polaires.

b. Composition de la phase mobile

Une telle séparation nécessite une polarité de la phase mobile qui lui est propre. Chaque solvant ayant une polarité donnée, la polarité globale de la phase mobile est réglée en introduisant plusieurs solvants miscibles ensemble. A cette composition de phase mobile correspond un pouvoir d’élution qui caractérise la capacité d'entraîner les solutés.

On peut utiliser un solvant pur ou un mélange de solvants : on dit alors qu’on travaille en mode isocratique.

Dans certains cas, il est utile de faire varier le pouvoir d’élution au cours de l’analyse. Si le mélange de différents solvants varie durant la séparation, on dit alors qu’on travaille en mode gradient.

Ces deux modes sont utilisés pour des analyses en chromatographie à polarité de phase normale ou inversée.

II.3.3. Appareillage :

[pic 6]

Figure II-2: Schéma de la chaine HPLC

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