Identification bactérienne

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- Microscopie électronique

Différentes forme selon les espèces :

Coccobacille = forme intermédiaire.

Identification de bactéries :

Culture par enrichissement, puis isolement car plusieurs microorganismes sont présents, puis étape d’identification reposant sur quelques critères fondamentaux :

- morphologie des colonies,

- forme et taille des cellules (état frais ou rapide coloration),

- coloration de GRAM,

- quelques caractères biochimiques simples d’orientation,

- mode respiratoire,

- mobilité.

- Enrichissement : fournir de l’énergie soit par dégradation de composés chimiques (chimiotrophes) ou provenant de la lumière (phototrophes), une source de carbone et d’azote, des sels minéraux notamment le Fer (+ éventuellement des facteurs de croissance).

Les milieux de culture

2 types de milieux : riches ou minimums

Si on part d’un échantillon liquide on procède ensuite à un étalement sur la boite de pétri (râteau ou microbilles).

Si on part d’un échantillon solide on utilise une oeuse pour réisoler les colonies (on parle d’ailleurs de réisolement en cadran).

Définition milieu sélectif :

- avec AB : si l’organisme qu’on suspecte possède un gène de résistance,

- de Drigalski : le colorant se fixe aux peptidoglycanes ce qui inhibe leur croissance : croissance des gram-. (a utiliser si dans l’échantillon après coloration on avait gram+ et gram– et qu’on suspecte un gram–).

- sels biliaires (comme dans le dépistage de salmonella dans l’industrie agro-alimentaire).

- de Chapman : très riche en sel (staphylococcus apparaît en doré d’où son nom sur ce milieu).

La température peut également être sélective (mésophile : T° optimale à 20°C ou 37° pour les bactéries pathogènes / psychrophiles = 10°.

Définition de milieux différentiels (milieux d’identification)

- utilisation du lactose, milieu MacConkey : enrichi en lactose mais présence d’autres sucres (car d’autres bactéries peuvent se développer). Un indicateur tourne au rouge si abaissement du pH. Les bactéries Lac + apparaissent en colonies rouges.

- étude du caractère fermentaire ou oxydatif, milieu rouge de phénol : vire au jaune en milieu acide (sous-produits digestion du Glu). Si présence de bulle d’hydrogène insoluble.

- test catalase (état frais + eau oxygénée) pour savoir si le MO possèdent une catalase (si bulles = présence).

- test uréase pour savoir si le MO possède une uréase (si rose = présence).

- milieu au jaune d’œuf pour savoir si la bactérie utilise les lipides.

- gélose au sang : bactéries hémolytiques ou non. Les zones plus claires autour des bactéries correspondent à des zones où les hémolysines des MO ont dégradé les hématies (halo clair autour).

- test de mobilité flagellaire, concentration d’agar importante (milieu semi-solide en boite ou en tube à hémolyse) : apparition de cercles concentriques allant vers le pourtour de la boite. En tube, le trouble se fait dans tout le tube = bactérie mobile.

- effet de l’oxygène : gradient d’oxygène dans le tube qui définit différents types trophiques

1 : aérobie obligatoire

2 : microaérophile

3 : anaérobie aérotolérant (ou anaérobie facultatif)

4 : anaérobie strict.

→ Galerie API pour les entérobactéries (incubation 24h à 37°)

Test de l’activité fermentaire.

Test de l‘activité enzymatique.

Systèmes automatisés qui en moins de 5h permettent l’identification des bactéries principales. Ou par spectrométrie de masse il faut juste au préalable avoir cultiver le MO et qu’il soit seul en présence. Analyse des composés bactériens.

Caractéristiques moléculaires :

On réalise des PCR sur l’échantillon pour faire de la taxonomie :

- sur le gène de l’ARN16S : car cette sous-unité du ribosome bactérien est très conservée au cours du temps : enfin en bleu régions très conservées (cibles des amorces) ensuite au sein de ce fragment on analyse les séquences des régions de faible homologie dont le séquençage permet de faire de l’identification bactérienne moléculaire.

Cela a permis de remettre en cause une multitude de liens phylogéniques préalablement établis.

- sur des gènes très précis caractéristiques de certaines espèces : notamment en cas d’urgence pour certains pathogènes (PCR à spectre étroit).

- des puces à ADN : pour donner un profil d’expression des ARNm.

- comparaison des protéomes (par séquençage ou par testage de différents AC).

La phylogénie moléculaire montre 12 groupes de bactéries.

Parmi les gram+ deux branches : fort GC%, haut GC%.

Parmi les gram– (purple bacteria) on trouve les proteobactéries (notation en α,β, gamma …)

Exemple de genres bactériens :

- Coques gram+ :

On trouve des bactéries commensales (de la peau, musqueuse, tube digestif, voire poumons) et environnementales.

Ex : Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococus pneumoniae (peut franchir la barrière méningées).

- Bacilles gram+ :

Ex