TP spécificité des actions enzymatiques : les glycosidases

...

Dès lors, nous pouvons comparer les rapports frontaux des différentes taches pour déterminer les structures possibles du diholoside. On prend comme distance de migration le haut de la tache, celle-ci étant dispersée. Nous avons obtenu un front de solvant identique pour chaque dépôt (7,3cm).

Premièrement, nous pouvons remarquer que le fructose migre plus que le glucose et le galactose. Ceci peut s’expliquer par le fait que la fonction cétone augmente le caractère apolaire de la molécule et est ainsi moins adsorbée par l’acétone.

Le tube 1 permet de vérifier que le diholoside ne subit aucun changement sans glycosidase, c’est le cas car il ne présente qu’une seule tache.

Le dépôt 9 permet d’observer 3 taches correspondant aux 3 oses présents dans le mélange : le glucose, le galactose et le fructose, avec des rapports frontaux proches de ceux des dépôts 1, 2 et 3.

Nous savons que s’il y a eu réaction avec la glycosidase, on doit obtenir 2 taches correspondant aux deux oses du diholoside. Ainsi, les dépôts 4, 5, 6 et 8 ne présentent qu’une seule tache : la glycosidase n’a pas eu d’effet sur le diholoside (les rapports frontaux sont proches de ceux du diholoside seul du dépôt 4). Cependant, nous pouvons observer deux taches avec le dépôt 7 contenant de l’α-D-Glucosidase. L’enzyme a permis d’hydrolyser le diholoside : le premier ose est donc l’α-D-Glucose. Aussi, la distance de migration correspond approximativement à la tache de glucose, ce qui permet de confirmer l’hydrolyse du diholoside. Etant donné que seule l’α-D-Glucosidase agit sur le diholoside, nous pouvons en déduire que le deuxième ose est une molécule de glucose.

On admet ici que la fonction alcool en position 4 est l’unique fonction pouvant s’impliquer dans la liaison osidique. De ce fait, nous pouvons émettre quatre hypothèses concernant la structure du diholoside :

- α-D-Glucopyranosyl (1→1) α-D-Glucopyranoside (non-réducteur)

- α-D-Glucopyranosyl (1→1) β-D-Glucopyranoside (non-réducteur)

- α-D-Glucopyranosyl (1→4) α-D-Glucopyranose (réducteur)

- α-D-Glucopyranosyl (1→4) β-D-Glucopyranose (réducteur)

Tous les composés sont sous leur forme cyclique la plus stable, à savoir pour le glucose la forme pyrane. Si le –OH anomérique du deuxième ose est engagé dans la liaison osidique, le diholoside ne peut pas être réducteur.

Un test à la liqueur de Fehling est réalisé dans 2 tubes : un tube témoin avec la liqueur de Fehling mais sans le diholoside, pour vérifier qu’un précipité ne se forme pas sans ce dernier, et un autre tube avec le diholoside en présence de liqueur de Fehling. Une fois les tubes chauffés, on remarque que le tube témoin est inchangé : la solution demeure bleue. En revanche, dans le second tube, un précipité rouge brique est apparu : il y a eu oxydation de la fonction aldéhyde par les ions cuivre. Par conséquent, le diholoside est réducteur car sa fonction anomérique a pu être oxydée et est donc libre.

A la suite de la CCM et du test à la liqueur de Fehling, nous pouvons en déduire la nature du diholoside : il s’agit de l’α-D-Glucopyranosyl (1→4) D-Glucopyranose, c’est-à-dire le Maltose.

Structure de l’α-D-Glucopyranosyl (1→4) D-Glucopyranose (Maltose) :

MICROPIPETTE :

(Voir feuille de résultats à la fin du compte rendu)

On calcule la masse de prélèvement en fonction de la température de la pièce, à savoir 22°C. En effet, d’après la norme DIN EN ISO 8655-6, à 22°C, le facteur Z en mL/g vaut 1,0033. On a donc 1g = 1,0033 mL = 1003,3 μL (valable uniquement pour l’eau).

Les volumes minimum et maximum sont issus directement de nos valeurs obtenues.

Le coefficient de répétabilité CV (%) vaut : CV = = pour 1000μL et pour celle à 200 μL. [pic 4][pic 5][pic 6]

La justesse E (%) se calcule avec : . On utilise le volume moyen donc pour la micropipette à 1000μL : E = . Pour la micropipette à 200 μL : [pic 7][pic 8][pic 9]

Volume nominal 1 : 1000μL

Volume nominal 2 : 200μL

Volume moyen (en μL)

998,093

195,543

Volume minimum (en μL)

930,059

180,594

Volume maximum (en μL)

1095,604

208,686

Ecart type (en μL)

40,781

9,732

Coefficient de répétabilité (en %)

4,086

4,977

Erreur type de la moyenne (standard error)

12,896

3,078

Justesse (en %)

-0,1907%

-2,2285%

Dès lors, nous pouvons comparer nos valeurs de répétabilité et de justesse avec celles de la norme ISO 8655 donnant les marges de limite d’erreur maximale tolérée.

Pour la micropipette 1000μL, E (justesse) doit être inférieure ou égale à +/- 0,8% : notre valeur est dans cette norme (= -0,1907%). Concernant la répétabilité, CV doit être inférieur ou égal à 0,3%, ce qui est loin d’être le cas pour notre valeur (4,086%).

Pour la micropipette 200μL, la justesse possède la même norme que pour celle à 1000μL, à savoir +/- 0,8%. La justesse n’est donc pas correcte au vu de notre résultat (-2,2285%). Il est de même pour la répétabilité car CV doit être inférieur ou égal à 0,4%, et notre valeur est de 4,977%.

Ainsi, la micropipette semble défaillante car la justesse et la répétabilité ne sont pas compris dans les normes fixées pour des marges de limite d’erreur maximale.

- CONCLUSION