Compte Rendu de TP sur les glycosidases

...

Le dépôt 4 correspond à un dépôt du diholoside sans enzymes, il nous sert de témoin négatif : si le diholoside n’est pas hydrolyse, on aura une tache avec un Rf similaire soit ~0,14. C’est d’ailleurs le cas pour les dépôts 6 et 8 qui correspondent respectivement au diholoside en présence de β-D-glycosidase et β-D-Galactosidase. Au vu de la spécificité des enzymes, nous pouvons en déduire que le diholoside ne contient ni de β-D-Galactose ni de β-D-Glucose.

Avec les dépôts 5 et 7, nous obtenons à chaque fois deux taches dont les Rf se rapprochent de ceux du D-Glucose et du D-Fructose. De plus les hydrolyses qui ont permises l’obtention de ces résultats ont été faite en présence de β-D-Fructosidase et α-D-Glucosidase. Les glycosidases étant spécifique de l’ose qui engage son –OH anomérique, on peut donc en déduire que notre diholoside se compose de β-D-Fructose et d’α-D-Glucose relié par une liaison qui engage les –OH anomériques de chacun des deux oses donc entre le C2 du fructose et le C1 du glucose.

Cette hypothèse est confirmée par un test à la liqueur de Fehling : en présence du diholoside, la liqueur de Fehling n’est pas réduite en Cu2O. La solution reste donc bleu sans qu’aucuns dépôts rouge n’apparaissent.

En solution, le glucose a plutôt tendance à se cycliser sous forme pyranique tandis que le fructose se cyclisera plus sous une forme furanique. Notre diholoside est donc de α-D-glucopyranosyl (1-2)β-D-fructofuranoside (ou β-D-fructofuranosyl (2-1) α-D-Glucopyranoside) plus communément appelé saccharose que l’on trouve par exemple dans la canne à sucre ou la betterave sucrière et dont voici la structure :

[pic 2]

Conclusion :

Lors de ce TP, nous avons déterminé la structure d’un diholoside en analysant par une CCM les produits de son hydrolyse par différentes glycosidases. La spécificité des glycosidases nous a permis d’en déduire sa composition : α-D-Glucose et β-D-Fructose et également les carbones qui sont reliés par la liaison osidique. Un test à la liqueur de Fehling nous a confirmé la nature de la liaison : n’étant pas réducteur, les oses composant le diholoside sont forcément reliés entre eux par une liaison faisant intervenir les deux –OH anomériques. La liaison est donc de type 1-2. Au vu de ces résultats, nous avons put en déduire que le diholoside inconnu était du saccharose.

Lors de ce TP, nous avons rencontré un soucis avec la CCM qui n’a pas donné de résultats exploitables la première fois : une erreur de manipulation, une mauvaise qualité de la plaque de silice ou de notre solvant peut-être en cause.

L’utilisation d’une P5000 pourrait-être envisagée pour l’élaboration du solvant : les 2mL d’eau à ajouter serait ainsi mesurer de façon plus précise qu’avec l’éprouvette graduée ce qui éviterai d’avoir éventuellement un solvant trop polaire.