Rapport de Biotechnologie

...

base dont le gène qui nous intéresse et qui code pour la résistance à l’antibiotique : le fameux gène BLA.

Comme expliqué dans le précédent paragraphe, les manipulations qui ont été réalisée dans le cadre de ce laboratoire vont concerner la transformation artificielle d’E. coli. Cette transformation va se faire à base de cations Ca2+ le tout à des températures inférieures à 0°C.

Les charges positives des ions calcium vont permettre la neutralisation des charges négatives du plasmide et vont permettre d’affaiblir la paroi cellulaire de la cellule cible.

De plus, un choc thermique (à savoir un changement brusque de température) va induire une différence de pression entre l’extérieur et l’intérieur de la cellule va être créé, rendant ainsi la paroi cellulaire partiellement perméable pour des plasmides qui vont donc pouvoir y entrer.

Il est important de signaler que ce genre de choc thermique est un facteur de mortalité des cellules. Il faut savoir aussi que toutes les cellules n’ont pas été forcément transformées lors de cette étape. D’après le laboratoire qui a fourni les plasmides qui seront utilisés, il y a la possibilité d’avoir jusqu’à 107 transformants dans 1µg de plasmide.

L’ampicilline qui va être utilisée est quant à elle un antibiotique dit à « large spectre » et qui fait partie de la famille des Bêta-lactamines. Cet antibiotique va agir sur les bactéries gram+ et gram- comme E. coli.

L’ampicilline est une molécule qui provient donc d’un champignon de genre Penicillium. Cette molécule va inhiber la transpeptidase (une enzyme indispensable à la synthèse des parois cellulaires).

Matériel

Micropipettes et embouts adaptés

2 tubes à visser stériles

Bain de glace

Bain marie

16 boites de pétri

Hotte à flux laminaire

Matériel de laboratoire classique (erlenmeyer, bec bunsen, pipettes pasteur …)

100 ml de milieu SOC gélosé AVEC 100 µg/ml d’ampicilline (antibiotique)

100 ml de milieu SOC gélosé SANS ampicilline

1µL de solution de plasmides pBR322 (AmpR) à 10ng/µL conservé à des températures >0°C

20 µL de suspension d’E. coli JM 109

Mode opératoire

Prendre une micropipette avec son embout adapté ;

Prendre les deux tubes à visser stériles et les annoter « témoin » et « non-témoin ». Dans cette expérience, il va y avoir deux types de cellules : celles qui vont subir la transformation suite à un contact avec le plasmide (les non témoins) et celles qui ne vont pas subir la transformation et seront donc toujours sensibles aux pénicillines des antibiotiques (les témoins) ;

Prélever 1 µL de plasmides pBR322 à 10 ng/µL depuis le tube placé dans le bain de glace (car il faut préserver les plasmides à une température inférieure à 0°C) et mettre le prélèvement précédent dans le tube « Non témoin » et placer les deux tubes à visser dans la glace;

Une fois cette étape réalisée, dévisser très rapidement le bouchon du tube des cellules compétentes, en prélever 2x25 µL et placer chaque prélèvement dans chaque tube à visser annoté et les laisser 30 minutes ;

Une fois ce délai écoulé, replacer les deux tubes dans la glace pendant 2 minutes avant de les ressortir pendant 2 minutes encore une fois ;

A proximité de la flamme d’un bec-bunsen, il faut ajouter 1 mL de SOC-glucose (peptone 20 g/L, extrait de levure 5 g/L, NaCl 10 mM, MgSO4 10 mM, glucose 2%) avant de mettre les échantillons pendant une heure dans un bain-marie à 37°C ;

Remarque : si le séjour est trop long à une température de 37°C – température physiologique d’Escherichia Coli, il va y avoir une prolifération des cellules et celles-ci seront donc difficile à dénombrer.

L’ajout du milieu nutritif SOC-glucose permet quant à lui aux cellules de se revivifier avant d’être mis en culture.

Pendant ce laps de temps, il va falloir préparer 8 boites de pétri avec le milieu SOC avec ampicilline (antibiotique) et 8 boites avec le milieu SOC sans ampicilline qui sécheront pendant 15 minutes sous une hotte à flux laminaire ;

Après une heure écoulée, récupérer les deux tubes qui étaient dans le bain-marie à 37°C et réaliser une dilution 10 000x avec chacun d’eux ;

Récupérer les 16 boites et y placer dans chacune 20µL, 50 µL et 100 µL de chaque tube ;

Comme il y a deux types de milieux (avec et sans ampicilline) et 3 volumes à étaler (20, 50 et 100 µL) et qu’il y a deux types de cellules (les cellules modifiées et les cellules témoins), cela fait donc 2 * 3 *2 = 12 boites de pétri à utiliser. Les 4 restantes étant des boites de « sécurité » en cas de problèmes (déchirement de la gélose, contamination quelconque, …)

Incuber les boites pendant une nuit à 37 °C

Résultats et interprétations

Résultats obtenus

A la fin de cette manipulation qui a pour objectif la transformation des cellules. Deux types de cellules dans deux milieux distincts vont être à étudier et à analyser. Cela signifie donc qu’il va y avoir 4 situations différentes.

Tableau 1: Résultats du comptage de colonnies

20 µL 50 µL 100 µL

SOC SANS ampicilline Cellules transformées

(dilution x10 000) 18 39 135

Cellules non transformées

(dilution x10 000) 51 37 112

SOC AVEC ampicilline Cellules transformées

(dilution x10) 446 1148 2148

Cellules non transformées

(dilution x10) 2 14 9

Analyse des résultats

Concernant