Localisation d’une activité enzymatique dans le foie de rat

...

[pic 5]

On a donc 1,96 mg de protéine dans le tube H 0,05

On peut alors calculer la concentration protéique de ce tube :

[pic 6]

La concentration d’ovalbumine dans le tube H 0,05 est donc de 39,2 mg/mL.

De la même manière on calcul la quantité et la concentration d’ovalbumine dans les autres tubes essais. Les quantités sont inscrites dans le tableau suivant.

On calcul la moyenne des concentrations de chaque fraction, on obtient :

[H] = 39,25 mg/mL

[S1]= 29,7 mg/mL

[S2]=23,95 mg/mL

[C2]= 37,5 mg/mL

[pic 7]

- Dosage de l’activité de la GDH

Pour localiser la GDH, nous avons mesuré son activité dans chaque fraction.

Pour cela, nous avons réalisé un dosage enzymatique de l’alpha-cétolgutarate et étudié le sens 1 puis le sens 2 de la réaction. C’est-à-dire dans le sens de la formation du glutamate par désamination oxydative de l’alpha-cétoglutarate. La GDH n’est pas pure, le NAD+ peut donc être consommé par d’autres enzymes c’est pour cela que nous avons ensuite mesuré la disparition du NADH qui absorbe à deux longueurs d’ondes, ici la mesure se fera à une longueur d’onde de 340nm.

Pour cela, nous avons réalisé des dilutions des 4 fractions, à des concentrations protéiques de 10 mg/mL pour la fraction H, S1 et S2 et de 5 mg/mL pour C2.

On obtient :

Dans la fraction de l’homogénat H par exemple, on utilise la relation C1V1 = C2V2

Avec C1 = 3902 mg/mL

C2 = 10 mg/mL

V2 = 2,5 mL

Ainsi V1 = (C2*V2)/C1 soit, V1 = (10*2,5)/39,2 = 0,63 mL

Pour atteindre le volume de 2,5mL on ajoute 2,5 – 0,63 = 1,87 mL de tampon

On prélève donc 0,63 mL de la solution de l’homogénat et on ajoute 1,87 mL de tampon pour diluer.

On procède de la même manière pour les trois autres fractions et on obtient,

Pour S1 : V1 = 0,84mL

Pour S2 : V1 = 1,04mL

Pour C2 : V1 = 0,33mL

[pic 8]

La réaction dans le sens 1 a lieu lors de l’incubation de ces dilutions pour doser l’activité enzymatique de GDH.

Par la suite, nous avons réalisé une deuxième gamme étalon avec une concentration connue d’alpha-cétoglutarate. Les valeurs de DO alors obtenues sont décroissantes, la pente de la droite est négative. Nous n’avons donc pas fait une représentation de l’absorbance en fonction de la concentration d’alpha-cétoglutarate mais de la variation d’absorbance en fonction de la concentration, ainsi la pente obtenue est positive.

Le tube A sert encore de blanc pour obtenir les diminutions de DO, car il permet de doser l’activité enzymatique initiale, c’est-à-dire, l’activité enzymatique totale. L’activé enzymatique diminue au cours de la réaction à cause de la consommation des substrats et la formation des produits, ce qui explique la diminution de DO et la pente décroissante.

Calcul de la quantité d’alpha-cétoglutarate, par exemple pour le tube B :

On sait que n = C*V

On a 0,1mL d’alpha-cétoglutarate à 1mM.

[pic 9]

On procède de la même manière pour les autres tubes et on obtient

Tube A : n = 0 μmol

Tube B : n = 0,1 μmol

Tube C : n = 0,2 μmol

Tube D : n = 0,3 μmol

Tube E : n = 0,4 μmol

Tube F : n = 0,5 μmol

Diminution de DO : DO du tube A – DO du tube étudié.

[pic 10]

Une fois les diminutions de DO et les quantités d’alpha-cétoglutarate de chaque tube calculées, on peut tracer la droite étalon variation DO340nm = f (quantité d’alpha-cétoglutarate).

A partir de cette droite étalon, nous avons pu déterminer la portion linéaire, calculer la pente en choisissant deux points, et ainsi calculer le nombre de moles d’alpha-cétoglutarate dans chacun des tubes essais correspondant aux différentes fractions.

On obtient donc :

Entre deux points, ici A (0 ; 0) et F (0,5 ; 1,202), on obtient une pente a de :

[pic 11]

La diminution de DO pour ces tubes se calcule en fonction de la DO du temps 0 de la fraction, en effet ce temps 0 sert de blanc, H0 sert de blanc pour la fraction H, S10 sert de blanc pour la fraction S1 et pareil pour les deux autres fractions.

Cette pente nous permet de déterminer les quantités d’alpha-cétoglutarate des tubes essais, par exemple pour le tube H4 :

On a quantité alpha-cétoglutarate = diminution de DO/ pente

Pour le tube H4 : [alpha-céto.] = 0,156/2,404 = 0,064

On procède de la même manière pour tous les autres tubes.

[pic 12]

[pic 13]

Lorsque l’on connait la quantité d’alpha-cétoglutarate de chaque fraction on peut tracer des cinétiques de formation de l’alpha-cétoglutarate en fonction du temps lors des incubations. Ce qui nous donne :

Cinétiques ! micromol d’alpha-céto = f (temps)

On obtient des courbes hyperboliques à partir