Enzymes de restriction cas

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C'est grâce à la technique de l'électrophorèse sur gel d'agarose que nous allons pouvoir distinguer la taille de nos fragments d'ADN. En soumettant ces fragments obtenus après digestion à un champ électrique et en les obligeant à traverser le gel d'agarose, les fragments les plus courts vont se déplacer plus rapidement que les fragments les plus longs. L'ADN étant de charge négative, les fragments vont donc être attirés par la charge positive, qui est en bas. En définitive, on pourra séparer les fragments en fonction de leur taille et on aura en bas les fragments les plus courts et en haut les fragments les plus longs. Ceci qui nous permettra d'estimer le nombre de paires de bases de nos fragments, cela grâce au marqueur de taille dont on connaît la taille des fragments au préalable.

III. Résultats

[pic 2][pic 3]

[pic 4]

M

C6

C5

C4

C3

C2

C1

[pic 5]

- Dans le tube de la piste C1, il y avait uniquement le plasmide pUC19, sans aucune enzyme de restriction. Nous pouvons voir sur cette piste 2 bandes, dont une un peu plus visible que l'autre. Celle peu visible fait 5'000 paires de bases et celle plus visible fait 4'000 paires de bases.

- Dans le tube de la piste C2, il y avait le plasmide pUC19 avec l'enzyme de restriction BamHi. Nous pouvons voir sur cette piste une bande de taille de 2'500 paires de bases.

- Dans le tube de la piste C3, il y avait une fois de plus le plasmide pUC19 avec cette fois l'enzyme de restriction MspI. Nous distinguons 7 fragments de taille allant de 500 paires de bases à moins de 200 paires de bases.

- Dans le tube de la piste C4, il y avait le plasmide pUC19-TIF1 sans aucune enzyme de restriction. On peut voir sur cette piste un gros fragment de plus de 10'000 paires de bases.

- Dans le tube de la piste C5, il y avait le plasmide pUC19-TIF1 ainsi que l'enzyme de restriction BamHI. On distingue 2 fragments sur cette piste. Le premier fait environ 6'000 paires de bases et le second 2'500 paires de bases.

- Enfin, dans le tube de la piste C6, il y avait le plasmide pUC19-TIF1 avec l'enzyme de restriction MspI. Sur cette piste, on distingue 6 fragments : un de 1'500 paires de bases, un de plus de 1'000 paires de bases, un de plus de 800 paires de bases, un de 500 paires de bases, un de 400 paires de bases et enfin un de moins de 400 paires de bases.

La piste M nous est utile afin de repérer la taille des fragments par rapport au marqueur de taille.

IV. Analyse des résultats

Nous allons analyser les pistes du groupe C, car ce sont les pistes qui sont les mieux ressorties lors de l'expérience et celles où on arrive le mieux à analyser les différents fragments.

- Commençons par la piste C1 : Nous pouvons donc voir sur la photo qu'il y a deux bandes, de taille d'environ 5'000 et 4'000 paires de bases. Cela veut dire que le plasmide n'a pas été coupé par une enzyme de restriction et donc qu'il n'y a pas eu de digestion. En effet, sans digestion, il n'a pas pu y avoir de fragments linéaires. Les fragments circulaires, eux, migrent bizarrement. En effet, ils sont de forme relâchée et donc ils migrent plus lentement ainsi que de manière aléatoire. Cela explique le fait qu'on trouve des fragments avec beaucoup de paires de bases, alors qu'en réalité, le plasmide pUC19 fait environ 2'500 paires de bases. De plus, il y avait dans le puits au début un grand nombre de molécules d'ADN circulaire et donc on peut penser qu'elles n'ont pas toutes migré de la même manière, c'est pour cela que nous avons une bande bien visible et une autre plus haut un peu moins visible. Ceci est en accord avec la théorie. En effet, dans le tube de cette piste, il y avait à la base uniquement le plasmide pUC19, sans aucune enzyme de restriction. De ce fait il ne peut pas y avoir de digestion et le plasmide n'a pas pu être coupé. Il y a donc bien dans cette piste des plasmides de formes circulaires, qui sont de forme relâchée et qui migrent donc anormalement.

- Pour la piste C2, nous pouvons voir un fragment de 2'500 paires de bases ainsi qu'un autre fragment que l'on arrive moins bien à distinguer et qui fait environ 5'000 paires de bases. Concernant le fragment de 2'500 paires de bases, nous pouvons dire que la digestion a bien marché. Le plasmide pUC19 a donc bien été coupé par l'enzyme de restriction BamHI. Celle-ci n'ayant qu'un seul site de restriction sur ce plasmide, il a donc été ouvert et est devenu linéaire. De plus, le plasmide pUC19 fait 2'686 paires de bases, ce qui est donc bel et bien la taille de notre fragment. Ce résultat est en accord avec la théorie, en effet, nous sommes censés trouver un seul fragment de taille de 2'686 paires de bases, ce qui est ce que nous avons trouvé. En revanche, pour le fragment de 5'000 paires de base, ce résultat est étonnant et pas en accord avec la théorie. Il s'agit sûrement de plasmides circulaires n'ayant pas été digérés et coupés par l'enzyme de restriction. Comme vu plus haut, les plasmides circulaires sont de forme relâchée et ne migrent pas de manière linéaire. C'est pour cela que ce fragment fait environ 5'000 paires de bases.

- Concernant la piste C3, on distingue 7 fragments différents allant de 500 à moins de 200 paires de bases, ce qui signifie que l'enzyme de restriction a coupé le plasmide en 7 fragments de tailles différentes allant de 500 à moins de 200 paires de base. Ces résultats sont en accord avec la théorie. En effet, dans le tube C3, il y avait le plasmide pUC19 ainsi que l'enzyme de restriction MspI. Par conséquent, nous aurions du obtenir 13 fragments de taille variant entre 500 et 26 paires de bases, car l'enzyme Msp1 a 13 sites de restriction pour le plasmide pUC19, comme nous pouvons le voir grâce à la carte de restriction du plasmide pUC19 pour l'enzyme mspI. Ce résultat obtenu n'est donc pas étonnant, sauf qu'on aurait du trouver plus de fragments. Cependant on peut penser que l'on ne voit pas les plus petits fragments.