ELECTROPHORESE DE PROTEINES, ELECTROTRANSFERT ET IMMUNOREVELATION.

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Par une lecture graphique nous avons déterminé le poids moléculaire apparent de l’ADH. Voir annexe.

Nous avons déterminé un PM apparent de 38459,2 Da pour l’ADH.

Nous avons réalisé l’électrophorèse SDS-PAGE uniquement avec un gel de 7,5% d’acrylamide, car le deuxième gel censé être préparé par nos camarades n’a pas pu être exploité. Ainsi nous ne pouvons comparer l’effet de la concentration en polyacrylamide sur le pouvoir résolutif des gels, mais nous pouvons supposer son impact.

En effet on sait que la taille des mailles du gel dépend de la concentration en polyacrylamide, ainsi plus la concentration de ce dernier est élevée plus les mailles seront resserrées. Ainsi les protéines devront être plus petites pour migrer.

Donc le pouvoir résolutif du gel dépend de la concentration en polyacrylamide, adapté en fonction de la taille des protéines utilisées. Dans notre électrophorèse, certains marqueurs sont sortis du gel, il aurait donc fallu utiliser un gel plus concentré en polyacrylamide.

- D’après le gel obtenu de l'électrophorèse, on constate, pour le puit E2, contenant la fraction purifiée donc notre lysozyme, une seule bande de faible intensité ayant peu migrée (distance de migration de 4,9 : cm). Ainsi on peut en déduire que cette unique bande correspond au lysozyme purifié, l’absence d’autre bande nous confirme une bonne purification du lysozyme. On ne retrouve aucune autre bande visible sur F1 ou F2 (autres protéines du blanc d’œuf).

Partie 2 : électrotransfert et immunorévélation de protéines sur membrane de nitrocellulose

A noter que nous n’avons fait que deux dépôts pour le western-blot, F1 et E2, car il n’y avait plus de place sur le gel d’électrophorèse.

Rappelons que l’échantillon F1 correspond au blanc d’œuf, et qu’E2 est notre lysozyme purifié.

Pour la membrane colorée au rouge ponceau, on observe une seule tache pour le dépôt E2. Celle-ci correspond donc normalement au lysozyme purifié. Pour le dépôt F1 plusieurs taches sont nettement visibles, elles correspondent aux protéines du blanc d’œuf ainsi qu’au lysozyme. On peut deviner la tache du lysozyme, celle qui a le plus migré, même si elle n’est que très peu visible. Les autres taches, autres protéines du blanc d’œuf, ont moins migré et sont plus rapprochées. On sait qu’elles ne correspondent pas au lysozyme car on ne retrouve pas ces taches pour le dépôt E2.[pic 2]

Contrairement à la révélation au rouge ponceau, on remarque pour l’immunorévélation moins de taches, seules celles que l’on supposait être le lysozyme. Ceci s’explique par la différence de spécifité de ces deux méthodes de révélation. Le rouge ponceau révèle toutes les protéines (révélation aspécifique) alors que l’immuno-révélation ne cible que le lysozyme dans notre cas (spécifique).

Ainsi les deux tâches identifiées pour l’immuno-révélation correspondent au lysozyme, purifié pour E2, et non purifié du blanc d’œuf d’origine.

Cette manipulation nous permet dans un premier temps de déterminer quelles taches correspondent au lysozyme, et de déterminer sa migration par rapport aux autres protéines, ce qui nous sert à identifier les taches de l’électrophorèse précédente. C’est une vérification supplémentaire de la purification de notre protéine.

Conclusion

Au cours de notre TP nous avons vérifié la pureté de notre lysozyme purifié. Dans un premier temps par une électrophorèse révélée au bleu de Coomassie nous avons mis en évidence la bonne purification de notre protéine, puisque nous n’avons observé une bande unique. Nous avons cependant vérifié par western-blot révélé au rouge ponceau puis aux anticorps anti-lysozymes, que la bande observée correspondait bien à du lysozyme, ce qui s’est avéré exact. Pour conclure, à l’issue de ces deux TP notre lysozyme a été purifié, et le contrôle de sa purification a révélé que l’échantillon obtenu n’était pas pollué par d’autres protéines.