Production et purification des protéines

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D /Extraire la protéine d’intérêt

- Centrifugation de la culture

- Récupération du culot bactérien (le surnageant est juté)

- Lyse bactérienne (désintégration des membranes cellulaires) :

- Congélation à -80°C / Décongélation

- Ajout d’enzymes lytiques (lysosyme : dégrade les membranes cellulaires)

- Sonication

- Homogénisation liquide (French press)

- Mécanique (blender, FastPrep)

- Centrifugation et élimination des débris cellulaires

- Filtration du Lysat

II. Purification de protéines :

FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

On suit l’absorbance de la lumière UV à 280 nm (longueur d’onde à laquelle l’absorbance des protéines est maximale) en fonction du volume injecté sur la colonne (fractions collectées)

On peut isoler une protéine ciblée se trouvant au sein d’un mélange en utilisant ses propriétés :

•Masse moléculaire de la protéine en Da

•Point isoélectrique de la protéine (pI)

•Hydrophobicité de la protéine

•Présence éventuelle d’un tag (Protéine recombinante)

Il est aussi important de connaître la composition de l’échantillon à purifier (autres protéines, acides nucléiques, lipides…)

Propriété de la protéine ciblée

Méthode

Reconnaissance d'un lignad spécifique (ex: tag) et/ou possibilité de la liaison à des ions métalliques

Chromatographie d'affinité (AC)

Charge (+ ou - )

Chromatographie par échange d'ions

Taille

Chromatographie d'exclusion stérique

Hydrophobicité

Chromatographie par interaction hydrophobe

Chromatographie en phase inverse

a. Chromatographie d'affinité (AC):[pic 1]

La chromatographie d’affinité permet de séparer les protéines en fonction de leur affinité avec la matrice de colonne, en se basant sur des interactions réversibles entre la protéine voulue et un ligand spécifique attaché à la matrice de la colonne. La protéine ciblée se lie à la résine de la colonne, tandis que les macromolécules sans affinité particulière pour les ligands spécifiques sont éliminées. Pour décrocher la protéine voulue de manière spécifique lors de l’étape d’élution, un gradient de ligand compétitif est utilisé.

- Tag : On a souvent recours à un « tag » (séquence spécifique ajoutée en N-terminal ou C-terminal de la séquence de la protéine voulue) quand on travaille avec des protéines recombinantes. Ce tag va permettre de séparer la protéine d’intérêt plus facilement du reste des autres protéines exprimées. Certains tags sont également utilisés afin d’augmenter la solubilité de la protéine.

- His tag : His-His-His-His-His-His

- Le His tag de la protéine d’intérêt se coordonne aux ions Ni2+ de la matrice de colonne.