Compte-rendu TP Séparation du lactose et protéines du lait

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IV- Protocole expérimental

De nouveau il se décompose en 2 grandes parties :

- Séparation des molécules d’intérêt : la chromatographie d’exclusion

1- Préparation de la colonne à chromatographie

2- Réglage du débit : normalement le débit aurait du être de 4 ml en 5 min soit 0,8ml/min. Comme notre colonne était neuve, le débit était bien trop rapide peu importe nos réglages. Nous avons donc décider de prendre un débit deux fois pus rapide, soit 1,6/min.

3- Introduction de l’échantillon de lait à analyser (avec déconnexion préalable du réservoir)

4- Elution (ouverture du robinet)

5- Obtention des fractions (de 4 mL chacune)

6- Rinçage de la colonne.

- Analyse des molécules d’intérêt : spectrophotométrie et réaction à la liqueur de Fehling

1- Spectrophotométrie

On transverse nos fractions obtenues, unes à unes dans des cuve en quartz vu qu’on va utiliser une longueur d’onde comprise dans le domaine UV pour l’analyse. On les place ensuite dans le spectrophotomètre et on obtient les absorbances de chacune.

2- Dosage du lactose : réaction à la liqueur de Fehling

Comme nous avions déjà compris le principe de la chromatographie d’exclusion, on se doutait que le lactose ne s’éluderait qu’en dernier et qu’il n’était donc pas nécessaire de rechercher sa présence avec la fraction 15 environ.

Nous avons donc pris les fractions 15 à 23, on les a placé dans des tubes à essai et ajouter dans chacun 1 mL de liqueur de Fehling. On place le tout à ébullition pendant 2 minutes et on observe un précipité rouge brique lorsque la présence de lactose est détectée.

V- Résultats

→ Voir diagramme d’élution (annexe 1)

Volume d’élution des caséines : le pic d’absorbance à λ = 280 nm est obtenu pour les fractions n°10, comme chaque fraction fait plus ou moins 4 mL, [pic 4]

Volume d’élution du lactose : le précipité rouge est obtenu pour la fraction n°19, comme chaque fraction fait plus ou moins 4 mL, [pic 5]

Volume total de la chromatographie (ml)

[pic 6]

Volume mort de la chromatographie (mL)

[pic 7]

Volume d’élution de la fraction protéique (mL)

[pic 8]

Volume d’élution du lactose (mL)

[pic 9]

VI- Interprétation des résultats

On observe ici que les protéines sont les premières à s’éluder avec un Ve = 40 mL correspondant approximativement au volume mort de chromatographie, V0.

Le lactose s’élude avec un Ve = 76 mL bien supérieur à celui des protéines. On en déduit donc que ces dernières ont une masse moléculaire bien supérieure à celle du lactose (en effet 35 kDa contre 342 Da).

Les protéines devraient avoir un volume d’élution bien plus proche du volume mort de la chromatographie qui est de 28 mL. Cela vient du fait que le débit de notre colonne était bien trop rapide, les protéines seraient apparues vers les tubes 8 ou 9 si le débit avait été plus lent.

En effet les protéines ont une masse moléculaire plus importante que la limite d’exclusion de la chromatographie au Séphalex G-25 (limite supérieure = 5 kDa) et migrent dans la colonne sans pénétrer la partie interne (le réseau de bille), elles s’éludent donc avec un volume d’élution égal au volume mort, alors que le lactose est lui retardé dans la colonne car son parcours est allongé et sort avec un volume d’élution bien plus grand.

VII- Conclusion

Cette manipulation nous a permis d’étudier l’ordre d’élution des composants du lait : grâce à la chromatographie d’exclusion les molécules de forte masse moléculaire sont éludées de la colonne en premier (les caséines) ne pouvant pénétrer les microbilles poreuses du gel et en dernier viennent celles qui présentent les masses moléculaires les plus faibles (ici le lactose).