TP - Etude de la chaine respiratoire.

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de Glutamate-Malate après celui des mitochondries nous donne un tracé similaire à celui du tracé 2, pour les mêmes raisons.

L’ajout successif de glucose, d’hexokinase et d’ADP se traduit par une augmentation de la pente. Il y a donc plus d’oxygène consommé en présence de ces composés : l’hexokinase nécessite de l’ATP pour la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate :

La présence de l’hexokinase permet une forte production d’ADP, donc la fabrication de plus d’ATP, au niveau de la chaine respiratoire (soit une plus grande consommation d’oxygène).

Il n’y a pas de retour à un état basal dans ce cas puisque l’ADP est régénéré à chaque transformation de glucose en glucose-6-phosphate, et est envoyé à l’ATP synthase pour recommencer un nouveau cycle. On renouvelle ainsi en permanence de l’ADP.

Tracé 3 bis

L’ajout de mitochondries et de Glutamate-Malate ont les mêmes effets que ceux décrits dans le tracé 2.

Il y a une légère augmentation de la consommation en O2 lors de l’ajout de glucose, d’hexokinase, du ClCCP et de l’ADP. Le ClCCP permet donc un transfert d’électrons encore plus important. Ici, il n’y a pas d’oligomycine donc pas d’inhibition possible pourtant le ClCCP augmente la consommation en oxygène. Le ClCCP « modifie » en quelque sorte l’action de l’ATP synthase en apportant des protons dans la matrice et en créant un gradient de protons plus élevé.

Il n’y a pas d’état de retour car l’ADP est régénéré de la même façon que le tracé 2 bis.

Conclusion sur ClCCP : voir calcul ATP/O.

Calcul de l’ATP/O pour tracé 2bis et tracé 3bis

C’est une mesure de l’ATP formé par l’ATP synthase au cours de la chaine respiratoire pour une certaine quantité d’oxygène consommée.

Dosage du Glucose-6-phosphate (G6P) :

L’ATP permettant le fonctionnement de l’hexokinase provient de l’activité ATPasique au sein de la chaine respiratoire. L’ADP formé peut refaire fonctionner le système dans les mitochondries. L’ATP est donc le réactif limitant dans la réaction (1).

(2)

Le NADH est dosé à 340 nm, longueur d’onde à laquelle il absorbe. Sa quantité est égale à celle de G6P formée dans la réaction (1) car le G6P est limitant dans la réaction (2). Or, dans la réaction catalysée par l’hexokinase, l’ATP est le réactif limitant. Donc nous avons les égalités suivantes :

Quantité d’ATP = Quantité de G6P dans la réaction (1)

Quantité de G6P = Quantité de NADPH dans la réaction (2)

Donc la quantité d’ATP est égale à la quantité de NADPH dosée par spectrophotométrie.

Le NADPH est donc équimoléculaire par rapport à l’ATP formé par l’ATP synthase dans la chaine respiratoire.

On sait que l’adénylate kinase est présente dans les mitochondries, une partie de l’ADP produit dans la réaction (1) est donc transformée par cet enzyme selon la réaction (3) qui parasite nos résultats :

Adénylate kinase

2 ADP AMP+ ATP (3)

On peut calculer la concentration en NADPH du milieu placé dans le spectrophotomètre (donc celle d’ATP) en appliquant la loi de Beer-Lambert :

A = ε.C.l

avec : - A : Absorbance mesurée (sans unité)

- C : Concentration en NADPH dans la cuve (M)

- l : longueur de la cuve (1 cm)

- ε : coefficient d’extinction molaire du NADPH de (6,22.103 M-1.cm-1)

° Pour le tracé 2 bis :

En déduisant la concentration en ATP, on pourra calculer le rapport ATP/O.

Pour cela on calcule (comme précédemment pour l’ADP/O) la quantité d’oxygène nox :

Vtampon respiration = 1,5 mL et Coxygène = 460.10-9 mol

Donc : nox = Vtampon respiration * Coxygène = 1,5 * 460.10-9 = 6,9.10-7 mol = 690 nmol

On sait que L totale correspond à 16cm et que la consommation en oxygène de 690 nmol correspond à 4,6cm.

Consommation réelle = (nox initiale(nmol) * consommation(cm))/ L totale(cm) = (690*4,6)/16 = 198 nmol

Par la suite, on calcul la concentration du NADPH en appliquant la loi de Beer-Lambert :

A = ε.C.l d’où C = A/(ε.l) donc C = 0,554/(6,22.103*1) = 89,1.10-6 M

Sachant que dans la cuve finale on a : nfinal = C*V

avec V =0,5(TEA)+0,5(essai)+0,01(NADP)+0,01(G6P DH)

V = 1,02 mL

D’où nfinal = 89,1.10-6 * 1,02.10-3 = 90,9 nmol

Sachant qu’on a prélevé 0,5 mL de surnageant sur un volume initial de 1,5 mL, on a donc pris 3 fois moins de matière qu’initialement.

Donc n surnageant = 3 * nfinal = 3 * 90,9 = 272,7 nmol

Cette matière de surnageant provient d’un millilitre ajouté à la solution de départ (V1) : Pour trouver la quantité présente dans le volume initial Vi=1,5+0,01+0,01+0,02+0,006+0,01= 1,556ml, on calcul :

ninitial=(Vi.n surnageant)/ V1= (1,556.272,7)/(1)= 424,3 nmol ATP

Donc rapport ATP/O pour trace 2 bis :

ATP/O= 424,3/198=2,14 mol d’ATP formée par mol d’O2 consommée.

Comparaison ATP/O entre le tracé 2 bis et 3 bis :

Pour le tracé 2 bis, on observe une valeur de ce rapport qui est presque 3 fois supérieure à celle du tracé 3 bis. Or la seule différence dans ces 2 protocoles est l’ajout