Modulation de la fonction des protéines

Modulation de la fonction des protéines

Acylation

Modifications covalentes des protéines par les lipides, elles vont entrainer des changements/modifications dans la fonction des protéines et leur localisation.

- Palmitoylation : addition d’un acide palmitique (16C) sur un résidu Cys,

- Isoprénylation : addition de farnésyl ou de génranylgénranyl sur un résidu de cystéine C-term : lipide isoprénique (constitué de la répétition d’unité à 5 atomes de carbones avec une insaturation) qui sont impliqué dans la biosynthèse du cholestérol.

Motifs qui permettent au prot d’être acylé à différents endroits par le même ou différents lipides, on retrouve ce motif dans certaines sous unités Galpha (prot G).

Modification joue sur la localisation donc sur la fonction.

La palmitoylation

- S-palmitoylation : addition d’un AP via liaison thioester sur un résidu cystéine interne (car que la chaine latérale de disponible)

- N-palmitoylation : addition d’un AP via liaison amide sur un résidu de cystéine N-term (car la groupement amide est libre en N-term)

Le processus de S-palmitoylation

Des enzymes sont capables de catalyser l’addition de l’AP sur la protéine. Si le mécanisme enzymatique est dérégulé on peut trouver un inhibiteur, dans le cas d’un processus spontanné il est compliqué de bloquer le processus. Ici famille des palmitoylacyltransférases : modification qui utilise le palmitoylCoA comme intermédiaire.

Le processus de N-palmitoylation

Addition via intermédiaire palmitoylCoA catalysé par des enzymes de la famille des MBOAT (membrane-bound O acyltransférase).

Les protéines palmitoylées

• récepteurs : récepteurs de neurotransmetteurs, intégrines et tétraspanines, récepteurs oestrogènes
• Récepteurs couplés aux protéines G et protéines G
• Canaux ioniques
• Protéines neuronales (régulation de la transmission synaptique par la palmitoylation)
• Protéines virales (régulation des interactions hôte-pathogènes)

Palmitoylproteome

L’ensemble des protéines suceptible d’être palmitoylées

Approche protéomique (on regarde sur l’ensemble des protéines) pour purifier et identifier les protéines palmitoylées et caractériser le palmitoyl protéome

On essaye de trouver l’ensemble des protéines palmitoylés : on utilise ABE (acyl-biotinyl exchange). Substitution du palmitoyl par la biotine. On va donc capturer les protéines bioténylé sur la streptavidine agarose (4 sites de fixations) (chromatographie d’affinité avec un fort Kd) liaison covalente très forte). On va éluer les protéines par clivage de la liaison cystéine-biotine via le B-mercoptoéthanol. Enfin, on réduit et alkyl les protéines purifiées. Pour les identifier on utilise la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) (digestion de la protéine par des enzymes et création de petits peptides).

PS : La digestion protéolytique par l’endoprotéinase Lys-C et la trypsine. Puis séparation par chromatographie 2D (chromato avec 2 principes différents pour permettre une meilleure séparation) : échange de cation + phase inverse.

Comment biotinyler une protéine ?

1. On bloque les thiols présents non palmitoylés (Utilisation du N-ethylmaleimide (NEM))
2. On catalyse la rupture des liaison thioester (utilisation d’hydroxylamine)
3. On fixe la biotine sur le groupement thiol libre (utilisation d’HPDP-biotin). Ceci permet de créer un pont disulfure qui pouyrra par la suite être hydrolysé pour l’élution lors de la chromatographie.

Hétérogénéité des sites de palmitoylation

Ici, on a pas de séquence consensus claire (analyse de séquence pas utile). On a quand même trouvé des dénominteurs commun pour la plupart des protéines palmitoylées :

- Séquence plybasique au voisinage des résidus de cystéines modifs