Microbiologie cas

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- Mesure de la consommation d'O2 au cours du temps par microorganismes

- Consommation qui sera proportionnelle au nombre d'individus

- Si microorganismes plutôt fermentaires, on va pourvoir mesurer la concentration en acide formés liés à la fermentation

- Mesure également de l'ATP/ADP/AMP qui est la charge énergétique

- Méthodes qui demandent un certain savoir faire

- Méthodes de numération :

- Augmentation du nombre d'individus au cours du temps

- Généralement rapporté à une concentration cellulaire au cours du temps

- Différentes méthodes utilisables

- Numération de tous les microorganismes (vivants + morts)

- Méthodes directes

- Comptage des cellules en microscopie photonique (on compte 1 par 1)

- Nécessite des cellules de numération (adaptées aux espèces microbiennes)

- Par exemple, cellule de Thomas pour les grosses cellules (0,05 mm de côté pour les petits carrés du quadrillage soit 0,2 mm pour un carré et 0,1 mm de hauteur)

- Ressemblent à lame d'observation de microscope

- On place échantillon microbien au milieu de la chambre

- Puis on place sous microscope et on observe

- Observation d'un quadrillage sur chambre avec différents types de cellules

- On veut déterminer un nombre de cellules par unité de surface

- Surface des 16 carrés = S = 0,05 x 0,05 x 16 = 0,04 mm²

- Volume des 16 carrés = V = 0,04 x 0,1 = 4 x 10^(-3) mm^3 soit 4 x 10^(-6) L

- Nombre de cellules comptés = 12

- Concentration = nombre / volume

- Attention, bien prendre en compte le facteur de dilution !!

- Avantages

- Rapide (quelques minutes)

- Peu de manipulations

- Pas de conditions stériles

- Inconvénients

- Ne convient pas à tous les types cellulaires (mobiles, filamenteux agrégés) → convient aux types cellulaires immobiles et isolés

- Comptage total (des cellules mortes et vivantes)

- Existe de manière automatique → comptage de particules (de Coulter)

- Passage des cellules dans un orifice calibré

- Électrodes mesurent un champ électrique

- Si cellules passent à travers électrodes, variation du champ électrique mesuré par un appareil

- Convient bien aux grosses cellules (levures, sang) mais peu précis pour bactéries (faussé si le milieu contient des particules solides)

- Méthodes indirectes

- Mesure du trouble cellulaire (= turbidité)

- Le développement de microorganismes dans un milieu liquide occasionne un trouble car leur nombre empêche le passage de la lumière au travers de la solution → ce trouble est proportionnel à la concentration cellulaire → la mesure se fait par spectrophotométrie (longueur d'onde de 500 à 600 nm)

- Fonctionnement

- On place une lumière incidente composés de photons vers l'échantillon. Si les photons rencontrent des microorganismes, ils sont absorbés, sinon ils passent au travers de l'échantillon. On mesure ensuite la valeur de la lumière transmise aux cellules photoélectrique

- DO = Log I0/I = K [cellules]

- La DO est proportionnelle à la concentration cellulaire mais dans une certaine gamme (DO

- Pour utiliser cette méthode il est nécessaire de mesurer la concentration cellulaire par numération en amont avec la DO mais aussi d'échelonner les périodes de mesure de DO dans le temps (ne nécessite pas de mesurer à nouveau concentration cellulaire)

- C'est une méthode rapide, facile et fiable

- Nécessité de faire une droite étalon

- Comptage des cellules mortes et vivantes

- Numération des microorganismes viables

- Méthodes de dénombrement indirecte (via une étape de culture)

- 2 méthodes :

- Dénombrement sur boit de Pétri (CFU)

- Méthode d'étalement basée sur la capacité des micro-organismes à former des colonies visibles sur des milieux solides (en boîte de Pétri)

- Le comptage se fait pour les colonies visibles

- Si les cellules récupèrent tous les nutriments nécessaires à leur développement, elles vont se diviser au niveau du lieu de dépôt → accumulation de cellule va former des colonies microbienne (ensemble de cellules qui dérivent d'une seule cellule microbienne)

- [pic 7]

- Méthodologie de dénombrement sur boîte de Pétri :

- Il est nécessaire de faire des dilutions de l'échantillon pour avoir des colonies isolées et non un tapis

- On effectue un prélèvement identique pour tous, que l'on va étaler sur une boîte de Pétri[pic 8]

- On incube puis on compte le nombre de colonies

- Si toutes les colonies se touchent → on parle de tapis ou de lieu de confluence

- On va prendre boîtes avec 30 à 50 colonies jusqu'à 300 à 500 colonies

- Concentration de l'espèce : C = (nombre de colonies/volume étalé) x facteur de dilution

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