Les protéines du lait
Par Plum05 • 13 Mars 2018 • 1 511 Mots (7 Pages) • 679 Vues
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Détermination de la concentration en caséine d'une solution :
La caséine est une protéine. Comme toute protéine, elle est formée par un enchaînement d'acide aminé et comporte entre autre trois Tyrosines. La Tyrosine libre est un acide aminé facile à doser. Pour déterminer la concentration en caséine d'une solution nous pouvons, sachant cela, mesurer sa concentration en Tyrosine.
L’hydrolyse de la caséine étant difficile à exécuter nous avons travaillé à partir de solution d’hydrolysat de caséines dans lequel seul 40% des acides aminés sont libres.
Le réactif utilisé pour doser les Tyrosine est le Folin ciocalteu ( qui vire du jaune au bleu en présence de Tyrosine ).
Le principe de ce dosage et de préparer à l'aide d'une solution de Tyrosine de concentration connue ( 50mg.L-1 ) et d'HCl 0,2M, une gamme étalon afin de pouvoir créer une courbe d'absorbance en fonction de la concentration de Tyrosine qui nous permettra de déterminer la concentration en Tyrosine de notre hydrolysat.
Afin d'obtenir une courbe relativement précise nous avons préparé 6 tubes de concentration croissante puis deux tubes, l'un de concentration X ( concentration de l'hydrolysat ) et l'autre de concentration X/2.
La création de la gamme étalon s'est faite de la manière suivante, nous avons préparé à l'aide de la solution de Tyrosine et d'HCl six solutions de concentration connue et nous en avons prélevé 500µL de chacune à l'aide d'une pipette micrométrique et déposé dans des tube à essai. Les tubes 7 et 8 ont été réalisé à l'aide de la solution d'hydrolysat de caséine et d'eau distillée ( pour la dilution du tube 8 ), ensuite 2,5mL d'NaOH à 0,2M et 0,25mL de réactif de folin ont été ajouté dans les tubes.
Tube
1 ( T )
2
3
4
5
6
7
8
Ctyr ( mg.L-1 )
0
10
20
30
40
50
X
X/2
Figure 4. Concentration en Tyrosine des différents tubes
Après avoir attendu 10 minutes et agité les tubes pour les mélanger nous avons procédé à une spectrophotométrie a 750nm en faisant le zéro grâce au tube 1 qui est le témoin. Grâce aux valeurs d'absorbance ainsi obtenues nous avons tracé la courbe d’étalonnage et nous nous sommes servi de cette courbe pour obtenir la concentration en Tyrosine de notre hydrolysat de caséine.
Séparation d'acides aminés provenant d'hydrolysat de caséines :
Avant tout, le principe d'une chromatographie sur couche mince est dans notre cas pour connaître la composition en acides aminés de nos peptides provenant d'hydrolyse. Avec ce type de chromatographie on retrouve une phase stationnaire ( support polaire ) qui correspond ici à notre cellulose et une phase mobile ( support apolaire ) qui elle migrera par capillarité. Le résultat attendu sera une montée plus ou moins importante selon si le caractère apolaire est grand.
Nous avons séparé des acides aminés de tripeptides provenant de la solution de caséines hydrolysées grâce à une chromatographie sur couche mince. On s'est servie de l'affinité des acide aminés pour la phase polaire ou apolaire ( qui dépend de la structure de leurs chaînes latérales ) afin de les faire migrer sur un film de cellulose ( polaire ) grâce à un solvant apolaire ( mélange d'eau ( 1/6 ) d'acide acétique ( 1/6 ) et de butanol ( 4/6 ) ).
Les trois acides aminés présents dans chaque tripeptide ayant une structure électronique et donc une polarité différente, leur migration sur le film de cellulose sont différentes ce qui permet de les séparer. On peut ensuite les identifier en comparant le rapport frontal ( Rf = Distance parcourue par le composé / distance parcourue par l'éluant ) de chacun d'eux au Rf d'acide aminé connu déposé sur la même feuille de chromatographie.
Le protocole a donc été le suivant :
Nous avons tracé sur la feuille de cellulose une ligne horizontale à 2cm du bord ( la ligne de dépôt ) sur la quelle nous avons déposé en les espaçant de quelques millimètres,12 acides aminés connus et deux hydrolysats de tripeptides inconnus.
Nous avons ensuite placé cette feuille dans une cuve en présence de l'éluant et laissé migrer durant 30 min ( le temps que la phase mobile atteigne les ¾ du film ). Ce délai expiré nous avons sorti la feuille, tracé la ligne de front puis aspergé d'une solution de ninhydrine ( 0,2%) avant de la faire sécher à l’étuve à 80°C.
Il ne nous a plus resté qu'à calculer le rapport frontal de chaque acide aminé et reporter les résultats dans un tableau afin de déterminer la composition des tripeptides ( figures 2a et 2b ).
ANNEXE
[pic 3]
Figure 5. Chromatographie sur couche mince des 12 acides aminés
Figure 6.[pic 4]
Figure 7.[pic 5]
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