Compte rendu de TP : Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative.

...

Nous avons mis au total 12 µL de témoin, ce qui équivaut à 1µg d’ADN. Par proportionnalité, on a :

m(fragment) = mT * Poids Moléculaire(fragment)/ Poids Moléculaire Total

Le PMtot est égal à la somme de tous les marqueurs de taille donc égal à 48177 pb.

Ex : m(fragment 5148 pb) = 1 * 5148/48177 = 0,1068 µg = 107 ng

PM(pb)

21226

5148

4973

4268

3530

2027

1904

1584

1375

947

831

564

Masse (ng)

441

107

103

89

73

42

40

33

29

20

17

12

Afin de déterminer la masse initiale de notre gène wzc, nous comparons l’intensité du signal de la bande du bas de la piste 7 de l’annexe 3 (électrophorèse N°1) avec celle d’une bande de la piste marqueur. Nous estimons que la bande contenant le gène wzc sur la piste 7 est 1,5 fois plus intense que celle correspondant au marqueur de 947 pb. Comme il y a proportionnalité entre l’intensité du signal et le PM, on peut déterminer approximativement la masse du gène wzc de la piste 7.

m(wzc piste 7) = 1,5*0,020μg = 30 ng

Nous estimons que la première bande a une intensité comprise entre les bandes de 1375pb et 1584 pb soit environ 31 ng.

Cependant, cela représente que 1/10e de notre quantité totale, ainsi nous avons 300 ng de gène wzc au départ et 310 ng pour l’autre fragment. Cela veut dire que nous avons au départ 610 ng de plasmide pUC18-wzc.

Nous avons prélevé 4 μL de plasmide de la solution de départ (PHC).

Nous avons donc :

[pUC18-wzc]i = masse-estimée / Vi = 610 / 4 = 152,5 ng/μL

[wzc]i = masse-estimée / Vi = 300 / 4 = 75 ng/μL

On a ensuite prélevé notre gène d'intérêt sur la piste 8 qui contient 9/10 de la solution de départ. Donc dans notre piste 8, on aurait 30*9=270 ng du gène wzc

(Annexe 4) Sur l’électrophorèse N°2, notre essai est situé la plus à droite. Le temps de migration a été moins important que pour la première partie. Ainsi, les marqueurs sont moins bien séparés que pour la première partie. Nous observons par ailleurs que 8 bandes sur les 12 attendues. Il est fort probable que certains fragments avec des poids assez proches n’ont pu être suffisamment séparés du fait du temps de migration plus court.

On estime que notre fragment (piste 2) est aussi intense que la bande correspondant à 1584 pb qui équivaut donc à une masse de 33 ng. Cette quantité représente 9/10e de notre quantité totale. Nous avons calculé que pour 9/10eme de la quantité totale, nous avions 270 ng de wzc sur notre piste 8. Ainsi, pour calculer le rendement de notre extraction qui est basé sur la piste 8, on a :

Rendement = [mWZCf / mWZCi] x 100 = 33 / 270 x 100 = 12,2 %.

On a associé à cette électrophorèse 2 puits où il y a présence d’ARNase ou non. Pour notre part, nous n’obtenons ce que nous souhaitons dans les pistes avec ou sans l’ARNase. Nous nous basons donc sur les résultats de nos collègues sur les pistes à proximité.

On remarque que sans ARNase on obtient une grosse tache (smir) qui correspondrait aux ARN dans notre puits. En effet, on avait au préalable essayé de purifier notre solution d’ADN avec de la soude+SDS ce qui aurait dû avoir comme conséquence la dégradation des ARN. Donc, cela voudrait dire que notre puits est quand même contaminé d’ARN donc que la purification à la soude+SDS n’a pas énormément marché.

4) Conclusion

Nous avons d’abord déterminer la carte de restriction du plasmide pUC18-wzc grâce à l’action d’enzymes de restriction et à l’étude d’une électrophorèse. Nous avons déterminé qu’il y avait 1 site de restriction pour l’enzyme SalI, 2 pour l’enzyme PuvI, 1 pour MluI, 1 pour EcoRI et 1 pour BamHI. La taille totale du plasmide est, d’après nos calculs et déterminations, égale à 5277 pb et la taille du gène wzc est de 2405 pb. Nous avons ensuite réalisé l’extraction du gène wzc grâce à une chromatographie d’anions.

A la suite de cette dernière, nous avons déterminé un rendement d’extraction équivalent à 12,2 %.

Cependant, la technique électrophorétique ne permet pas de déterminer avec certitude la taille des fragments ni même la masse des fragments contenus dans les puits. Les approximations sont trop souvent nombreuses pour avoir une certitude sur le placement des sites de restriction à la paire de base près (électrophorèse, détermination de la gamme de linéarité, manipulation, détermination à vue d’oeil). L’électrophorèse est plus une technique qualitative que quantitative. On peut malgré tout déterminer les positions relatives des sites ainsi que les quantités.