Compte rendu de TP Biochimie sur les Caséines.

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pu peser le poids sec de caséine dans 20 mL de lait de vache. Nous avons aussi trouvé la concentration de caséine dans une solution inconnue et enfin nous avons réussi à identifier la composition de 2 tri peptides grâce à la chromatographie de partage sur couche mince.

Ces techniques nous aussi permis de comprendre un peu plus les interactions entre les molécules, les protéines et les acides aminés mais aussi de se rappeler des consignes de sécurité pour pouvoir manipuler avec un minimum de risque.

V. Matériel et méthode

Pour travailler sur une protéine, il faut l’isoler des autres. Il faut donc faire une précipitation isoélectrique. Ce principe permet de présenter une protéine à une solubilité minimale. C’est-à-dire que la protéine à un pH où les molécules sont électriquement neutres et donc leur agrégation est facilitée par l’absence de répulsion entre elles. Dans un premier temps, nous devons ajouter 5mL d’acide acétique dans 20 mL de lait écrémé et laisser reposer 5 minutes. Ceci permet d’arrivé à un point isoélectrique. Nous avons centrifugé, ensuite, le mélange pour récupérer le dépôt. Nous avons ajouté 10mL d’éthanol à 70% puis nous avons centrifugé à nouveau en éliminant le surnageant. Nous avons répété cette opération mais avec de l’éthanol à 95%. Nous avons récupéré le dépôt et laissé sécher 24 heures. Il ne resté plus qu’à peser.

Le dosage de la quantité de la tyrosine libre permet de connaître la concentration en caséine d’une solution purifiée et hydrolysée. Cette hydrolyse a été faite par des laborantins pour des questions de sécurité. Il faut utiliser du Folin Ciocalteu comme réactif pour le dosage colorimétrique des tyrosines. Nous avons donc réalisé deux séries de test : une gamme étalon avec une solution pure de tyrosine et un dosage de tyrosine libre dans l’hydrolysat de caséines. Pour créer la gamme étalon, nous avons préparé 6 tubes à essais de différentes concentrations de tyrosines et d’hydrolysat de caséines grâce à un Pipetman (P1000). Ensuite, nous avons préparé des échantillons d’hydrolysat avec 1mL de la solution mère et 2mL de la solution diluée au demi.

Et pour finir, nous avons ajouté, dans un nouveau tube, 500µL de chacune des solutions préparées, 2,5mL de NaOH [0,2mol/L] et 0,25mL de Folin puis nous avons mesurée l’absorbances à 750nm.

Pour séparer des acides aminés provenant d’hydrolysat de caséines il faut utiliser la technique de chromatographie de partage sur couche mince, c’est-à-dire qu’il y a une phase stationnaire (support polaire) sur une ligne de dépôt composé de 14 acides aminés connus et 2 fois chaque hydrolysat de tripeptide chaque dépôt doit faire une dimension de 1 à 3 mm et une phase mobile (solvant apolaire) composé d’eau (1/6), d’acide acétique (1/6) et de butanol (4/6). Cette chromatographie est réalisée dans une cuve de verre close où le mélange à analyser est déposé à l’une des extrémités de la feuille et ensuite mise en contact avec la phase mobile. Il faut ensuite mettre le dispositif sous une hotte aspirante à cause des vapeurs du butanol. Il ne faut pas oublier d’enlever le chromatogramme lorsque la phase mobile atteint les ¾ du film et tracer le front du solvant au crayon à papier.