Compte rendu d'enzymologie

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Trypsine (mg)

Chymotrypsinogène (mg)

Trypsine (mg/mL)

1mg

100mg

2 mg

1 mL

2mg

200mg

0.2 mg

0.1 mL

Nous avons donc prélevé 0.1 mL de Trypsine pour la mettre dans le tube d’Eppendorf contenant du chymotrypsinogène. Dans une cuve témoin, nous y avons mis 2700 µL de solution Tampon d’activité et 300 µL de DMSO, cette cuve nous a servi de mesurer le temps 0 d’activation.

Dans chaque cuve, nous avons mis 2700 µL de Tampon d’activité et 300 µL de substrat Bz-Y-pNA, au fur et à mesure nous y avons ajouté 10 µl du mélange d’activation, pour démarrer la réaction. Avec du parafilm nous avons mélangé la cuve pour obtenir un mélange homogène. Puis nous avons mesuré chaque cuve avec un spectrophotomètre pendant 2 minutes toutes les 15 secondes.

Nous avons prélevé et mesuré toutes les 5 minutes du chymotrypsinogène, en effet, il nous a fallu 7 mesures pour trouver un activité chymotrypsique constante.

- Élimination

Afin d’éliminer la trypsine, une chromatographie d’affinité a été préalablement faite, elle est constituée d’un gel de sépharose préalablement activé au bromure de cyanogène et couplé à la p-aminobenzamidine, qui est un ligand spécifique de la trypsine active.

Sur la colonne contenant le gel nous y avons versé le mélange de 2 mL contenant de la chymotrypsine et la trypsine, la trypsine ayant une affinité avec le ligand s’accroche à ce dernier et le reste du mélange passe à travers. Nous avons recueilli dans deux tubes d’Eppendorf par fractions de 1 mL, la chymotrypsine.

Mais nous avons, tout de même, élué la chymotrypsine non retenue avec 5 mL de solution tampon d’élution de la chymotrypsine dans des tubes d’Eppendorf. Nous avons recueilli dans les tubes d’Eppendorf l’éluât par fractions de 1 mL de la solution, soit 5 tubes au total.

Puis nous avons élué la trypsine retenue sur le gel de sépharose à l’aide de 5 mL de solution d’élution de la trypsine pour régénérer la colonne ce qui permettra de détacher la trypsine retenue sur la colonne.

Nous avons ensuite mesuré l’absorbance à 280 nm de chaque tube d’Eppendorf afin de quantifier l’activité chymotrypsique sur le Bz-Y-pNA. Les deux éluâts où la chymotrypsine était la plus concentré ont été regroupé, ceci constitue le Pool Chymotrypsine.

Nous avons mesuré l’absorbance de notre Pool, nous avons trouvé 0.489 A.mn. Pour trouver la concentration de nos deux cuves mélangées nous avons effectué un produit en croix, reporté sur ce tableau :

ε1%280 nm

Concentration

16

g-1.100 mL.cm-1

1 g / 100 mL

0.489

0.03 g / 100 mL = 0.3 g / L

Pour trouver la concentration de notre Pool Chymotrypsine nous avons utilisé le pourcentage de DMSO qui est de 10% soit un 20ème, nous avons donc effectué les calculs suivants :

[pic 3]

[pic 4]

La concentration de notre Pool Chymotrypsine est donc de 6 g/L.

-

Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme

Dans la deuxième partie du TP nous avons fait varier la concentration du substrat en faisant varier le volume utilisé. Nous avons étudié cette variation en présence et en absence d’inhibiteur. Nous avons choisi différentes concentrations de substrats, dans le tableau ci-dessous, afin que dans la représentation de Lineweaver-Burk les rapports 1/[S] soient répartis de manière homogène sur l’axe des abscisses.

[S]

0,02

0,0258

0,0363

0,0615

0,2

1/[S]

50

38,75

27,5

76,25

5

Pour trouver le volume de Chymotrypsine à ajouter, nous avons utilisé la formule V = n / C, V = 50 x 10-6 / 6 = 8.33 µL, ce qui est inférieur à 10 µL, donc nous avons pris 10 µL de volume de Chymotrypsine.

Pour trouver la concentration initiale, il faut utiliser la relation : Ci x Vi = Cf x Vf soit Ci = (Cf x Vf) / Vi

Vf = 3.0 mL ; Cf = 0.2 mM ; Vi = 2.0 mL ; Ci = ?

Pour chaque valeur de concentration du substrat, nous avons calculé la valeur de la concentration initiale :

- Ci = 2.0 x ? = 0,2 x 3 = 0.03 mM

- Ci = 2.0 x ? = 0,0258 x 3 = 0.0387 mM

- Ci = 2.0 x ? = 0,0363 x 3 = 0.05454 mM

- Ci = 2.0 x ? = 0,0615 x 3 = 0.09225 mM

- Ci = 2.0 x ? = 0,20 x 3 = 0.30 mM

Nous avons reporté les valeurs sur le tableau ci-dessous :

Essai

Volume Tampon

Volume DMSO (mL)

Volume Substrat (mL)

Volume Chymotrypsine (µL)

[S] (mM)

1/[S]

v (ΔA/mn)

1/[v]

1

Qsp 3 mL

(0.3 – v1)