Compte rendu du travail pratique de bioenergentique

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Vf : Volume final en L

Ci.Vi = Cf. Vf

Avec Ci : Concentration initiale en mol/L

Vi : Volume initial en L

Cf. : Concentration finale

Vf : Volume final

2. Modes opératoires :

Avant de broyer les feuilles d’épinards, on prépare 3 solutions : A,B et C qui serviront dans la suite de l’expérience à préparer les membranes thylakoïdes :

Solution A : 50 ml Solution B: (50 ml) Solution C :

NaCl( 50mM) dilution de MgCl2 50 ml (5mM) NaCl (10mM)

Sucrose (0,3M) HEPES (20mM)

Na2HPO4 (50mM) MgCl2 (5mM)

H2O 40 ml H2O (80ml)

Avant de préparer ses solutions nous devons d’abord calculer la masse de chacun de NaCl, Na2HPO4, NaH2PO4, HEPES et sucrose, on utilise cette formule : m/M=C×V → m= CxVxM

Solution A Solution C

AH1 AH2

NaCl 0,146g 0,146g 0,06g

Na2HPO4 0,3549g -----------

NaH2PO4 ----------- 0,354g

HEPES ----------- ------------ 0,48g

sucrose 5,13g 5,13g

Solution A :

Solution C :

Solution B :

On va diluer notre solution mère de MgCl2

Nous avons : Cf= 5mM, Vf= 50ml et Ci=250mM donc Vi= CfX Vf/ Ci= 1mL

L’étape suivante est la préparation des membranes thylakoïde :

1. Le broyage d’épinard dans la solution A (hypertonique) permet de casser les cellules extérieurs. A la suite de la centrifugation 5 min a 200 x g , on récupère le culot que l’on resuspend avec le milieu B , on effectue ainsi un choc hypotonique par le sel , en faisant entrée l’eau on observe un éclatement des chloroplastes .

2. Après une deuxième centrifugation de 10 min, on obtient un culot correspondant aux thylakoïdes qui est homogénéisé dans 3 mL du milieu C et conservé sur glace . La glace empêche des réactions de se déroulés dans les systèmes biologiques, cette conservation est importante lors des manipulations.

3. On extrait alors les pigments (contenues dans les thylakoïdes) par l’acétone : enlever 100µl de la suspension de thylakoïdes et l’ajout à 9,9 ml d’un mélange d’acétone/H2O (80/20%). Ce dernier dénature les protéines, on obtient alors un gros agrégat qui par la suite fera l’objet d’une filtration, celle-ci débouche sur une solution limpide qui pourra être utilisé pour la spectroscopie.

L’étape qui suive est mesuré l’absorbance par une spectroscopie pour déterminer les concentrations de chlorophylle, chlorophylle a et chlorophylle b d’après les D.O obtenue :

Cuve à incubation spectrophotomètre

1. Dans la cuvette de mesure (3ml de milieu C) ajouter 10 µl de suspension et observer la DO à 670nm

2. Ajouter le volume nécessaire jusqu’à obtenir DO auteur de 1 : V≈ 42ml

3. Enregistrer ensuite un spectre d’absorption entre 400 et 700 nm

4. Prélever 3 ml d’extrait de pigments par l’acétone dans une cuve et déterminer la DO à 645, 652, 663 nm, enregistrer également un spectre entre 400 et 700 nm.

La dernier étape est mesuré l’activité photosynthétique qui est le principal but de TP en utilisant l’électrode de Clark :

Electrode de Clark

Le volume nécessaire(Vi) à enlever de la suspension thylakoïdes pour préparer une solution de 10 ml (Vf) avec une concentration de 0,1 mg/ml (Cf) de Chl en utilisant le milieu C est :

On a la formule : Cf.Vf=Ci.Vi

Vi= Cf.Vf/Ci = (0,1.10)/0,6=1,66 ml

Diviser cette solution en 5 tubes avec 2 ml chacun :

1. Mettre la tension de l’enregistreur à l’échelle de 2mV/cm et la vitesse de défilement à 2mm/s

2. Régler la plume du bord gauche de l’enregistreur

3. Placer les lampes d’illumination à proximité de la chambre

4. Mettre en route le défilement de l’enregistreur et illuminer la suspension

5. Enregistrer jusqu’à l’obtention de maximum de déviation

6. Déterminer l’activité d’après la pente de courbe obtenir

Tout d’abord nous allons mesurer l’activité photosynthétique des thylakoïdes isolés puis nous allons mesurer encore une fois son activité en rajoutant des accepteurs artificiels d’électrons (DCBQ et ferricyanure) et un herbicide (DCMU).

III. Résultats

Voir Annexes : (annexe 1 : courbes de la spectrophotométrie, annexe 2 : courbe l’activité photosynthétique)

1. Spectroscopie

Valeur de DO mesuré pour la solution de pigments à différentes longueurs d’onde :

DO 645 nm = 0,149

DO