Compte rendu TP Génétique

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3 - Calculs Volumes - Amp, IPTG, LB-agar, DO bactérie

Amp

IPTG

DO bactérie

Poudre agarose

solution mère à 50 mg/mL

solution mère à 100 mM

à 14h la densité optique doit être de 0.6

On a une poudre à 0.8% pour 100mL

concentration attendue : 50 μg/mL dans 50mL

0,5 mM dans 50mL

On commence la culture bactérienne a 11h30 dans 10mL

il y a donc un facteur 1000 donc on prelève 50μL (50mg/1000)

il y a un facteur de 200 donc on prélève 0,25mL (50/200)

donc 0.6 / 2/2/2/2/2 = 0.2

Entre une DO de 2 et 0.2, on a un facteur 100, donc pour 10mL de bactéries on prélève à l’aide la pipette P200 0.1mL (= 100μL) de bactéries que l’on dilue dans 10 mL d’eau.

100 x 0.8/100 = 0.8g

4 - Préparation/Transformation des bactéries compétentes

5 - Préparation du gel d’agarose pour l’électrophorèse

[pic 20]

On ajoute dans 1 tube falcon stérile 0,1 mL de bactérie + 10 mL de milieu LB

Incuber à 37°C sous agitation jusqu’à une DO de 0.6 (environ 2h30 - 3h)

On centrifuge pour avoir un dépôt de bactérie au fond du tube pendant 5 minutes.

On vide le surnageant et on ajoute directement 2,5mL de MgCl2 et 1mL de CaCl2 qui va permettre de diminuer leur croissance pour éviter une trop grande prolifération qui pourrait causer un manque de nutriment et donc leur mort, ou même pas de production du plasmide en protéine. On fait tout cela près du bec benzène dans la zone stérile.

[pic 21]

on dissout 0.8g de poudre d’agarose dans de l’eau distillée dans un erlenmeyer que l’on va chauffer afin de dissoudre complètement la poudre.

Ensuite on coule le gel dans le bac à électrophorèse.

On utilise le peigne pour faire des puits dans le gel et on verse 10 uL de nos 4 échantillons contenant le tampon de charge.

On fait attention à ne pas déborder des puits. L’ADN tombe au fond des puits grâce au tampon de charge.

On laisse alors migrer à 100 V pendant 30 minutes.

On incube le gel dans un bain de Bromure d’éthidium et on observe sous UV les bandes d’ADN.

6 - Boites de pétri LB-agar

Faire fondre le milieu LB-agar au micro-onde pour la stérilité.

Attendre 15 minutes que le milieu refroidisse

On ajoute 50μL d’ampicilline et 250μL d’IPTG

On coule stérilement, cad autour du bec benzène électrique le milieu complet dans 4 boîtes de Pétri stériles et on laisse refroidir près du bec.

LB : c’est un milieu de culture nutritif bactérien.

S’il y a une bulle dans la pipette on diminue le volume avec la molette.

IPTG : c’est un analogue de l'allolactose qui permet la synthèse de la protéine DsRed T3.

Résultat Analyse

Observation des boîtes de pétri après 24h d’incubation dans une chambre chaude à 37°C.

- T+ D+ : On ne voit aucune colonie bactérienne sur cette boîte de pétri.

- T- D- : On peut voir dans cette boîte de pétri 2 colonies bactériennes, 1 rose, et 1 blanche.

- T- D+ : On ne voit aucune colonie bactérienne sur cette boîte de pétri.

- T+ D- : On voit 1 seule colonie bactérienne rose dans cette boîte de pétri.

[pic 22]

[pic 23]

[pic 24]

[pic 25]

Après amélioration du contraste

Globalement on ne distingue pas de façon nette les bandes entre les 4 puits du gel.

Parce que les amorces 2 sont plus difficiles à observer, et aussi que le gel d’agarose est moins sensible que la culture bactérienne.

- T- D+ : On ne voit qu’une bande inférieure présente pour chaque puits. On ne voit pas de bande supplémentaire.

- T- D- : On distingue une bande supplémentaire au-dessus de la bande du bas vu précédemment.

- T+ D- : On distingue très faiblement une bande supérieure et nous avons toujours la bande inférieure.

- T+ D+ : On obtient quasiment la même chose que le puits précédent.

Discussion

[pic 26]

Voici les résultats que nous devons obtenir pour l’électrophorèse si tout se passe bien.

On remarque que les résultats obtenus pour les amorces 1 sont plus significatifs que les amorces 2.

Pour les 4 puits, on distingue très nettement la bande inférieure qui correspond à nos amorces.

T- D- : On distingue la bande inférieure qui correspond aux amorces, et une bande supérieure relativement faible qui correspond au plasmide d’origine (normal).

T- D+ : On distingue seulement la bande inférieure. Le plasmide d’origine a été digéré par DpnI

T+ D- : On distingue une bande supérieure plus