TP - Extraction d'ARN

...

Concentration = 122,7 µg/ml

Notre solution n’étant pas assez diluée, nous avons procédé à une seconde dilution :

Dilution 1/30ème :

Par ces résultats, nous avons pu calculer le ratio :

Ratio (R) = A_260/(A_280 ) = 1.027/0.664 = 1,55

Discussion

Tout au long de nos manipulations, nous avons constaté que notre échantillon changeait d’apparence selon l’ajout de tel ou tel produit. Effectivement, lors de l’ajout du TRI-REAGENT, la préparation s’est opacifiée. Ceci est dû au contenu cellulaire des tissus qui s’est déversé dans le TRI-REAGEANT (seul, le TRI-REAGEANT est rose translucide). Ce dernier a eu pour rôle de broyer les tissus et d’ainsi, lyser les cellules afin de libérer l’ARN situé dans le noyau. Ensuite, dès que l’on a ajouté le chloroforme dans le tube, il a coulé au fond puisqu’il est très dense. En tombant, il a interagit avec des protéines de l’ARN pour les lester au fond du tube. Le mélange au vortex a permis d’homogénéiser correctement la préparation (chloroforme se mélange mal) et nous avons constaté que la solution est devenue blanchâtre. L’ajout d’isopropanol, lui, a fait apparaître un « nuage » blanc. Ceci s’explique par le fait que l’isopropanol et l’ARN ont commencé leur précipitation. A la fin de celle-ci, la solution est redevenue visuellement « normale ».

En ce qui concerne nos résultats, nous avons pris différentes longueurs d’onde pour les mesures d’absorbance. Celle à 320nm servait à mesurer le bruit de fond et n’avait aucun intérêt pour notre analyse. Grossièrement, elle correspondait à un calibrage interne de l’appareil. En outre, les mesures à 260nm et 280nm ont été faites puisque nous savons que la plupart des acides nucléiques et des protéines absorbent à ces longueurs d’onde, respectivement (Figure 1, encadré bleu).

En cherchant sur internet, nous avons trouvé qu’un ARN est dit « pûr » lorsque son ratio tourne autour de 2. Le nôtre était à 1.55. Nous avons obtenu une valeur bien inférieure à celle optimale. Ceci pourrait s’expliquer par une contamination lors de nos manipulations. Pourtant, nous avions pris des précautions en utilisant le tube RNase Free.

Pour la concentration de notre échantillon, nous avons visualisé 41.08 µg/ml (Figure 1, encadré organge). Or, la quantité optimale pour un échantillon d’ARN est de 40µg/ml à 260nm. En cela, notre préparation était quantitativement similaire à la valeur de référence.

De plus, il est à noter que notre concentration initiale en ARN était 10 fois plus concentrée que celle observée puisque nous avons fait une dilution au dixième (puis au trentième). Donc, la concentration initiale était égale à :

CiVi = CfVf

D’où,

Ci = CfVf/Vi = (122.7 x 0.1)/0.01=1227 µg/ml

Donc, la concentration initiale en ARN était égale à 1227 µg/ml.

Conclusion

Nos résultats ont permis de mettre en évidence un taux de contamination relativement important dans notre échantillon ce qui a altéré la qualité/pureté de celui-ci. En revanche, quantitativement, nous sommes prêts de la valeur de référence.

De nos jours, cette technique d’extraction d’ARN est couramment utilisée en biologie moléculaire. C’est une méthode simple et financièrement très abordable. Les extractions d’ARN (ou autre molécule telle que l’ADN) sur colonne sont également adoptées en laboratoire, cependant, elles ont l’inconvénient d’être plus