Séparation d'ADN par électrophorèse analytique et préparative.

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NB : Nous avons inversé les dépôts pour les puits 6 et 7 (tubes 5 et 6) et pour les puits 8 et 9 (tubes 7 aux 2 dilutions)

Etant donné que nous séparons les différents fragments grâce à une électrophorèse, la masse d’un fragment donné est proportionnelle à sa distance de migration lorsque l’on se trouve dans la zone de linéarité du gel. Nous nous proposons de déterminer cet intervalle. Ainsi, nous réalisons la représentation graphique (sur Excel et sur papier millimétré) du :

Taille fragment (pb) = f (distance de migration (mm)) (Annexe 1, graphique 1 excel)

Les bandes de faible migration (pour les fragments de haut poids moléculaire) étant difficilement distinctes les unes des autres (formation de petites traînées due à la présence d’un nombre de molécules de BET trop élevé), il est difficile de déterminer de manière précise la taille des fragments correspondant à ces bandes ; elles ne font donc pas parti de la zone de linéarité. Par ailleurs, le marqueur est constitué d’une 13ème bande de 125 pb qui n’est pas visible sur ce gel du fait soit de sa petite taille (il serait donc sorti du gel), soit d’un nombre de molécules de BET incorporées insuffisant pour avoir une fluorescence visible. Nous décidons donc de linéariser la représentation graphique 1 à l’aide du tracé des log (taille des fragments) en fonction des distances de migration (mm). Les résultats obtenus sont résumés (Annexe 1, tableau 1). Nous obtenons les tracés :

Log (taille fragment (pb)) = f (distance de migration (mm)) (Annexe 1, graphique 2 excel) et (Annexe 2, papier)

A partir du tracé Excel de cette linéarisation, nous remarquons que nous obtenons une droite pour des distances de migration comprises entre 26,5 et 57,5 mm ; nous obtenons donc notre zone de linéarité pour ces valeurs et nous décidons de représenter cette gamme (Annexe 1, graphique 3 excel) et (Annexe 2, papier). A partir du tracé Excel, nous obtenons l’équation de droite :

Equation (1) : Log (taille fragment (pb)) = -0,0178 x (distance de migration (mm)) + 3,7712

Notre zone de linéarité du gel s’établit donc entre des distances de 26,5 et 57,5 mm de migration ce qui correspond à des fragments de taille comprit entre 564 et 2027pb (nous obtenons 555 et 1993 pb à partir des calculs réalisés avec l’équation (1))

Les tailles de fragments migrant à moins de 26,5 mm ne pourront donc pas être déterminées par le calcul. Toutefois, afin de déterminer la taille totale du plasmide à partir du puits 9, nous supposerons que la zone de linéarité est obtenue à partir de 22,5 mm de migration et jusqu’aux plus petites valeurs (de l’ordre de 66 mm de migration) soit des fragments de [505 ; 395] pb

Afin de déterminer la taille du plasmide pUC18-wzc, on utilise le puits 9 car les distances de migration (22,5 et 26mm) des 2 bandes se trouvent dans le domaine de linéarité ; on obtient donc : [pic 4][pic 5]

Pour déterminer la taille des bandes (1) et (2), on utilise l’équation (1) reliant la taille du fragment à sa distance de migration :

[pic 6]Exemple de calcul pour la bande (1) ayant migrée de 22,5 mm :

[pic 7]

On procède de la même façon pour tous les autres calculs des fragments se situant dans l’intervalle de linéarité. [pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13]

Ainsi, la taille de notre plasmide est de 4382 pb. Nous utiliserons cette valeur pour déterminer la valeur des bandes non comprises dans la gamme de linéarité par soustraction des bandes de tailles connues.[pic 14][pic 15]

- Puits 1 : Marqueur de taille

Le marqueur de taille correspond à l’ADN du phage lambda (MW) qui a été complètement digéré par EcoRI et HindIII. La taille des fragments après cette digestion est connue (13 bandes Annexe 1, tableau 1) et permet de déterminer la taille des fragments des autres puits. Dans les conditions de migration (agarose 1%), la zone de linéarité est comprise dans un domaine que nous avons élargi entre 22,5 et 66 mm de migration soit une taille de fragment comprise entre 395 et 2348 pb.

Nous avons représenté les 2 droites de linéarisation avec le logiciel Excel (Annexe 1, Graphiques 3 et 4). Nous avons donc déterminé 2 équations à partir de ces tracés, permettant de relier la distance de migration au log (de la taille des fragments) :

Equation (1) : Log (taille fragment (pb)) = -0,0178 x (distance de migration (mm)) + 3,7712 (Graphique 3)

Equation (2) : Distance de migration (mm) = -56,022 x (log (taille du fragment)) + 211,31 (Graphique 4)

- Puits 2 : Plasmide non digéré

On remarque une seule bande ayant migrée de 12,5 mm. Aucune enzyme de restriction n’ayant clivé ce plasmide, il est toujours sous forme native. En comparant avec le puits 3 qui lui possède également une seule bande correspondant au plasmide linéaire (clivé une seule fois). Il est important de noter que l’ADN migre différemment selon la forme sous laquelle il se trouve (super-enroulée, circulaire ou linéaire). Sous forme super-enroulée, le plasmide a tendance à se faufiler dans les mailles du gel car il est beaucoup plus compacté et moins encombré. Il migrera donc plus que s’il était sous forme linéaire ou circulaire. En revanche, s’il se trouve sous forme circulaire, il va occuper un volume beaucoup plus important. Il migrera donc moins. Ici, on remarque que lorsque le plasmide est sous forme native, il migre moins que lorsqu’il est sous forme linéaire (12,5 mm contre 15 mm quand il est linéaire), on peut donc en déduire que le plasmide natif est sous forme « open circle » ou circulaire. Même si la migration est moins importante, le plasmide mesure bien 4382 pb comme calculé plus tôt à l’aide du puits 9.

- Puits 3 : Plasmide + SalI

Le clivage du plasmide par SalI produit une seule bande avec une distance de migration de 15 mm ; le plasmide est donc sous forme linéaire. On en déduit que le plasmide possède un seul site de restriction SalI. On ne peut pas déterminer la taille du plasmide sous forme linéaire car il ne se situe pas dans la zone de linéarité du gel. En revanche, on remarque qu’il migre environ entre la 4ème et la 5ème bande du marqueur (entre 4973 et 4268 pb) soit aux alentours