Sujet biochimie 2015

...

1e. Analyser le profil d'élution de la chromatographie d'exclusion (figure 2)

2. Composition globale du domaine C-terminal de la calmoduline

10µL d’une solution de C-ter calmoduline, réduite et carboxymethylée (0,34 mg/mL) sont soumis à une hydrolyse acide totale. Le mélange d’acides aminés est traité par l’isothiocyanate de phényle. Les acides aminés sont séparés et quantifiés par HPLC (silice microgranulaire sur laquelle sont greffées des chaînes aliphatiques en C8). L’élution de la colonne est réalisée à l’aide d’un gradient eau/méthanol. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :

Acide aminé

pmoles

Ala

1648

Arg

824

Asp

4120

CM-Cys[pic 7]

0

Glu

6180

Gly

1648

His

412

Ile

1236

Leu

2060

Lys

2472

Met

2060

Phe

1236

Pro

0

Ser

824

Thr

824

Trp

0

Tyr

824

Val

2472

Questions :

2a. Donner l'intérêt des différentes étapes utilisées pour la détermination de la composition en acides aminés d’une protéine

2b. Déterminer la composition en acides aminés du domaine C-ter calmoduline?

3. Séquence primaire du domaine C-terminal de la calmoduline

La séquence est réalisée sur la protéine réduite et carboxyméthylée.

- Un séquençage automatique sur la protéine entière selon la méthode d’Edman a donné le résultat suivant :

DAEEELKEAFKVFDKDQN

- Le traitement de la protéine par le bromure de cyanogène permet d’obtenir 3 peptides et un tripeptide dont les séquences N-terminales réalisées sont données si après :

DAEEELKEAFK

INLGEKLTDEE

IKEADLDGDGQ

TVR

- Le traitement par la chymotrypsine pendant un temps court conduit à l’obtention d’un mélange de peptides. Ces peptides sont séparés et séquencés complètement selon la méthode d’Edman. On a sélectionné 4 de ces peptides dont le séquençage a donné les résultats suivants :

DAEEELKEAFK

KVFDKDQNGYISA

ISASELRHVMINL

EEFVKMMMTVR

- Le traitement par la trypsine pendant un temps court conduit à l’obtention d’un mélange de peptides. Ces peptides sont séparés et séquencés complètement selon la méthode d’Edman. On a sélectionné 4 de ces peptides dont le séquençage a donné les résultats suivants :

DAEEELKEAFK

LTDEEVEQMIKE

EADLDGDGQVNYEEF

HVMINLGEKLT

Les peptides résultant des coupures enzymatiques et chimiques sont purifiés par HPLC (chromatographie hydrophobe, colonne C18). Leur élution est réalisé à l’aide d’un gradient eau/acétonitrile en présence d’acide trifluoroacétique.

Questions :

3a. Donner le principe détaillé du séquençage des protéines par la méthode d’Edman

3b. Quelle est l’action du bromure de cyanogène?

3c. Que fait la chymotrypsine ? Que fait la trypsine ?

3d. Déterminer la séquence primaire complète du C-ter calmoduline