Biochimie structurale. Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC.

...

une mesure de l’absorbance à une longueur d’onde donnée des substances.

Il existe de nombreux autres type de détecteur (spectrométrie de masse, fluorescence, résonance magnétique nucléaire).

Schéma d’une chaîne d’HPLC et de l’injecteur :

Schéma 1 de l’injecteur : Le solvant passe directement de la pompe à la colonne, cela permet le remplissage de la boucle d’injection.

Schéma 2 de l’injecteur : Le solvant diffuse de la pompe vers la boucle d’injection jusqu’à la colonne. Cela permet l’injection de l’échantillon.

III. Protocole.

Nous détaillerons principalement les conditions opératoires de l’HPLC au cours de cette partie.

- Concernant la colonne utilisée, on utilise une pré-colonne afin de protéger la colonne. C’est une colonne en acier de petite taille (3 cm x 2,1 mm) en raison de la taille réduite du peptide à étudier. La phase stationnaire est à base de silice avec une greffe en C8 de chaînes aliphatiques afin de la rendre apolaire. La porosité des grains est de 300 angströms et la granulométrie de 7 microns. Le fait d’avoir des grains homogènes au sein de la colonne permet aux différentes espèces chimiques de rencontrer le même nombre de grains, on obtiendra alors des pics plus fins (résolution améliorée).

- La phase mobile diffuse à un débit constant de 1 mL/min. Il est important d’avoir un débit constant afin d’améliorer la qualité de séparation des espèces chimiques. Cette phase est constituée d’un gradient linéaire d’acétonitrile en TFA à 0.1%. Cela permet notamment de neutraliser le caractère ionique lors de la séparation. L’acétonitrile permet de diminuer la polarité de la phase mobile (qui est initialement très polaire, c’est-à-dire à 99,99% d’eau pour le solvant A).

Ainsi on utilise deux solvants pour la phase mobile : le solvant A composé de 0,1% de TFA, le reste étant de l’eau et le solvant B composé à 90% d’acétonitrile et à 0,1% de TFA.

- On utilise un programme de gradient lors de l’expérience sur un temps total de 14 minutes. En conditions initiales, la phase mobile est constituée de 95% du solvant A et de 5% du solvant B. Cela permet la fixation des molécules. En 12 minutes, la phase mobile contiendra 70% du solvant A et 30% du solvant B. Cela permet la séparation des molécules dû à la diminution de la polarité. EN 2 minutes, la phase mobile contiendra à nouveau 95% du solvant A et 5% du solvant B. Cela permet de revenir aux conditions initiales de fixation des molécules.

L’utilisation d’un gradient d’élution permet de séparer les constituants ayant des temps de rétention proches, on a ainsi une meilleure résolution des pics.

- La détection des composés issus du peptide s’effectue par absorption dans le domaine des UV à 214 nm. On effectue une mesure à 214 nm et non pas à 280 nm car les peptides n’ont pas forcément de composés aromatiques. Il faut aussi utiliser des solvants de haut degré de pureté afin d’avoir une meilleure transparence pour l’absorption dans les UV. Le solvant est filtré afin d’éliminer les particules étrangères éventuelles pouvant influer sur l’absorption.

- Quatre injections sont effectuées au cours de ce travail pratique, une injection « blanche », une injection du peptide non digéré, une injection du peptide digéré et une injection de l’éluat issu de la colonne d’afinité. Pour les deux premières injections, on utilise un volume de 250 uL de tampon (NaCl 0,15 M, Tris-HCl 10 mM, pH = 7,4) pour l’injection blanche et de 250 uL de peptide à 0,1 mg/mL (dans du NacL 0,15 M, Tris-HCl 10 mM, pH = 7,4) pour l’injection du peptide non digéré. Pour la 3ème injection, on injecte 150 uL de peptide digéré contenant le milieu tampon, du PMSF (0,5 M) et du DTT (0,1 M). Pour la dernière injection, on injecte le volume total de l’éluat obtenu contenant le site actif du peptide interagissant avec l’héparine, le milieu tampon, le PMSF et le DTT.

- Rôle des différents produits utilisés :

- Le TFA (acide trifluoroacétique) est un acide fort chargée négativement et hydrophobe. Il agit en tant qu’ion compensateur pour la chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions. C’est-à-dire qu’il se lie aux peptides basiques et chargées positivement et sur les parties hydrophobes. Cela permet d’éliminer le caractère ionique des composés pour leur séparation.

- L’acétonitrile permet une diminution de la polarité de la phase mobile. Il en résulte une augmentation de l’interaction avec les chaines alkyles de la phase stationnaire et une modification de la force d’élution. On aura ainsi une meilleure séparation des composés.

- L’eau est utilisée dans la phase mobile pour avoir un solvant polaire.

- L’alpha chymotrypsine permet la digestion du peptide d’intérêt afin d’obtenir différents composés qui seront analysés. On obtient 2 sous peptides après la digestion (coupure au niveau des acides aminés aromatiques).

- Le PMSF (phénylméthylsulfonyl-fluoride) est un inhibiteur des protéases à sérine. Il permet l’arrêt de la réaction enzymatique par inhibition de l’activité de l’alpha chymotrypsine.

- Le DTT (dithiothréitol) est un agent réducteur, il permet la réduction des ponts disulfure afin de dénaturer la protéine.

- Le milieu tampon (NaCl et Tris-HCl à pH = 7,4) permet le maintien de l’intégrité de la protéine (stabilité et fonction) avec un pH favorable à son étude. De plus le tampon Tris est transparent dans le domaine des UV.

- Le gel d’héparine-Sepharose permet la sélection et la fixation du site actif du peptide étudié avec l’héparine. Les zones du peptide n’ayant pas interagit seront éliminées.

IV. Résultats – interprétations.