Les problèmes d'dahérences et problèmes physiologiques cellulaires associés

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- Peser 92.7mg (balance de précision) d’acide borique

- Laisser dissoudre dans 15 mL d’eau

- D’après la formule d’Henderson-Hasselbalch, on observe qu’il faut ajouter 195µL, (P200) de soude à 1M pour avoir une solution tampon à pH 8.4.

pH = pKa + log ([B]/[A])

8.4 = 9.28 + log ([B]/[A])

log ([B]/[A]) = 8.4-9.28

log ([B]/[A]) = -0.88

[B]/[A] = 10^-0.88

[B]/[A] = 0.132

On assimile les concentration à des quantité de matière et on obtient:

nB/nA = 0.132

([B] * Vb) / ([A] * Va) = 0.132

[B] * Vb = 0.132 * [A] * Va

Vb = ( 0.132 * [A] * Va) / [B]

Vb = (0.132 * 0.1 * Va) / 1

Vb = 0.0132Va

Va +Vb = 15*10^-3

Va = 15*10^-3 - Vb

Vb = 0.0132 (15*10^-3 - Vb)

Vb = 0.0132 * 15*10^-3 - 0.0132Vb

Vb + 0.0132Vb = 1.98*10^-4

Vb(1 + 0.0132) = 1.98*10^-4

1.0132Vb = 1.98*10^-4

Vb = 1.98*10^-4/1.0132

Vb = 1.954*10^-4 L

Vb = 0.195 mL

Vb = 195 µL

protocole solution tampon borate 0.1M 0.001% poly L-lysine:

- Peser 92.7mg (balance de précision) d’acide borique

- Laisser dissoudre dans 15mL d’eau

- Ajouter 195µL (P200) de soude à 1M pour ajuster le pH à 8.4.

- Dissoudre 1mg (balance de précision) de poly L-lysine dans 10mL d’eau pour obtenir une solution à 1%

- Ajouter 15µL(P20) de cette solution à 1% dans le tampon borate pour qu’il soit à 0.001% en poly L-lysine.

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Protocole expérimental

Mise en culture primaire de cellules neuronales et fibroblastiques à partir d’embryon de poulet à 7 jours de développement, ces cellules n’étant pas matures (stade pluripotent) elles vont pouvoir se différencier in vitro.

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Mécanismes d'adhésion et de migration cellulaire

Extraction des hémisphères cérébraux à J-0

- Dispersion des cellules après dissection (élimination des méninges)

- Mise en culture dans trois milieux différents, avec DMEM base et DMEM 20% SVF :

- Poly - L - lysine : support in vitro artificiel (in vivo, on trouve plutôt de la Poly - D - lysine).

- Fibronectine : milieu existant à l’état in vivo (extraite de plasma de bœuf).

- Plastique : milieu permettant d’apprécier le comportement des cellules sans éléments propres à la MEC.

- Étuve à 37°

J+7

- Renouvellement des milieux avec du DMEM 20% SVF (en laissant un peu du milieu précédent qui contient des facteurs de croissance synthétisés par les cellules elles-mêmes ).

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Marquage subcellulaire de cultures primaires de fibroblastes

Extraction des fibroblastes J-0

- Élimination des viscères, vaisseaux sanguins, membres, colonne vertébrale et tête de l’embryon.

- Dilacération des tissus restants.

- Mise en culture dans deux boites contenant du milieu CEF:

- Une avec 0,2 mL de pré-culture de fibroblaste.

- L’autre avec 1 mL de pré-culture de fibroblaste.

J+7

- Remise en culture des fibroblastes en choisissant la concentration après comptage sur cellule de Mallassez soit à partir de la boîte à 0,2 mL soit à 1 mL.

J+15

- Marquage subcellulaire à l’acridine orange des acides nucléiques des fibroblastes.

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Résultats

Quelque soit le milieu de culture, le support, et le type de cellules utilisées, au moment de la mise en culture (pas d’adhésion au support) les cellules ont toutes une forme ronde. On peut observer parfois quelques agrégats cellulaires dû à une mauvaise dilacération des tissus. Cependant le mélange présente un aspect général homogène.

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1ère Partie : MÉCANISMES D'ADHÉSION ET DE MIGRATION CELLULAIRE

[pic 3]

Observations faites à J+7 et J+15

Culture neuronale sur support plastique (sans revêtement spécifique) (x200):

On observe uniquement des cellules étoilées et beaucoup de cellules rondes qui flottent dans le milieu de culture.

[pic 4]

Culture de cellules neuronales sur support poly-L-lysine (x200) :

On observe essentiellement des éléments foncés présentant des extensions filamenteuses. Ces éléments forment de gros amas d’où partent plusieurs filaments, extensions de cellules. On observe aussi quelques cellules rondes flottantes.

[pic