Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC

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- Tris-HCl (pH 7,4) : Tampon permettant de garder un pH constant.

- Résultats et interprétation.

Tr = Temps de rétention = Temps auquel est élué un composé à partir du moment où le gradient commence.

- Blanc (injection blanche) :

[pic 1]

Le blanc a été effectué en injectant le tampon NaCL 0.15M, Tris—HCL 10 mM, pH=7 (utilisé pour dissoudre le peptide).

Il sert à repérer d’éventuels pics fantômes qu’on retrouverait alors sur les autres chromatographes et indépendants de la manipulation.

TR = 0.5 min : Pic d’injection : composé du NaCl et du Tris-Hcl qui n’ayant aucune affinité avec la phase stationnaire passent directement au travers de la colonne. Ils sont en effet très polaires.

Tr = 3.8 min : petit pic. Or nous n’avons pas injecté de composé devant être retenu puis élué.

Ce pic pourrait venir du solvant or il n’est pas retrouvé dans les blancs des autres machines. Les solvants ayant été fait en même temps cela veut donc dire que cela ne vient pas d’une contamination des solvants.

Ce pic pourrait venir du tampon mais là encore nous verrions le même partout.

Il s’agit donc certainement de l’élution d’un composé qui était resté dans la colonne ou d’un artefact de chromatographie (pic fantôme).

- Injection du peptide seul non digéré.

[pic 2]

Tr = 0.5 min : Pic injection contenant les composés du tampon qui sont très polaires (NaCl, Tris-HCl).

TR = 9.7 : pic d’élution du peptide. Le pic a une bonne intensité et est clairement identifiable.

On constate des épaulements de part et d’autre du pic. Cela est dû à l’élution d’un composé proche de notre peptide. En effet nous utilisons un peptide commercial pur à 70%. Cela veut dire qu’il y a environ 30% de peptides qui ressemblent à notre peptide mais avec une séquence légèrement différente. Ces peptides ont donc un temps de rétention très proche de notre peptide mais légèrement différent en raison du très grand pouvoir séparatif de l’HPLC.

Tr = 3.8 léger pic fantôme. Il est plus petit que dans le blanc ce qui laisse à supposer un contenu qui aurait été retenu dans la colonne et qui est « lavé » au fur et à mesure des runs.

- Injection du peptide digéré.

Premier graphique à grosse échelle

[pic 3]

A cause de la présence d’une bulle d’air, on note une courbe étrange au début du run. En effet nous devrions avoir un pic à 0.4 min et un à 2.2. La bulle d’air a créé un pic artefact entre les deux à 0.7 min.

Tr = 0.4 pic injection. Il y a élution du tampon de NaCl, Tris-HCl ainsi que du DTT.

Tr = 2.2 : élution du PMSF. Il est légèrement retenu grâce à ses groupements hydrophobes. Il est de plus très bien détecté à 214 nm grâce à son cycle aromatique.

Pour la suite de l’analyse nous allons revenir à la même échelle que les autres chromatographes.

[pic 4]

Nous voyons distinctement deux pics correspondant à l’élution de nos deux fractions d’enzyme.

Nous avons ainsi un peptide élué à 5.3 minutes et un à 7.6 minutes. Ils correspondent chacun à une partie de notre peptide.

Hydrophobe

Polaire

AVELRSPGISRF : Fragment 1

RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE : Fragment 2

Nous sommes en phase inverse donc le composé le plus apolaire est le plus retenu. Il sera donc élué après. On constate que le fragment 2 est plus polaire que le 1. Il sera donc élué en premier.

On a donc

Tr = 5.3min = Fragment 2 (RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE).

Tr = 7.6 = Fragment 1 (AVELRSPGISRF).

On constate des pics parasites (6.10, 6.4…) ainsi que des épaulements (7.3). En effet l’alpha-chymotrypsine coupe préférentiellement après les résidus à chaine aromatique elle peut hydrolyser après d’autres résidus volumineux. Nous avons fait une digestion ménagée pour éviter cela mais malgré cela l’enzyme a toujours une chance de couper à d’autres endroits.

Tr = 9.7 : On constate encore un léger pic correspondant à notre peptide entier. En effet la digestion ménagée a été arrêté avant que tout le peptide soit hydrolysé et nous avons donc encore du peptide non hydrolysé.

- Injection du peptide retenu par l’héparine.

[pic 5]

Tr = 0.7 : Il y a élution du tampon de NaCl, Tris-HCl ainsi que d’éventuelles traces de gel d’agarose.

Tr = 5.4 : Le pic majoritaire correspond au peptide ayant été retenu lors de la chromatographie d’affinité par l’héparine. C’est donc ce peptide qui possède le site d’interaction avec l’héparine. En comparant ce chromatographe avec celui du peptide digéré (l’HPLC étant une méthode très reproductible) nous constatons que c’est le fragment 2 (RRKIAKRSIKTLEHKRENAKE) qui est présent dans notre échantillon purifié.

Tr = 7.9 et 9.7 correspondent respectivement à des résidus de fragment 1 et de peptide non digéré qui ont mal été lavé lors de l’étape de rinçage de la chromatographie.

Tr = 6.4, 6.5 = ce sont surement des peptides ressemblant au fragment 2 (soit à cause du caractère non pur de la solution de peptide soit à cause de la digestion) dont le site d’accrochage à l’héparine est tout de même fonctionnel malgré la différence avec notre fragment d’intérêt. Ils sont donc élués à des temps légèrement différents et sont très minoritaires.

- Conclusion.

L’héparine est présente dans les mastocytes