Compte rendu de biotechnologie

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Préparer deux solutions de culture (MS et G) (composition cf tableau au-dessus)

Calcul des volumes à prélever : exemple des macroéléments en milieu MS

[pic 7]

[pic 8]

- Mettre en place une agitation puis mesurer le pH avec du papier pH. Ajuster si nécessaire au environ de 5.7. (avec de l’acide ou de la soude peu concentrée).

- Séparer de manière homogène la solution dans 7 erlenmeyers MS et un erlenmeyer G. Ainsi chaque erlenmeyer contient 5.67ml de solution.

- Ajouter les phytohormones aux concentrations suivantes :

Tableau 4 Concentrations de phytohormones dans chaque solution

Tubes

P1

P2

P3

P4

P5

ANA (auxine de synthèse)

0

0.6

11.5

17.5

5.8

Cytokinine (benzyladéine)

0

11.7

11.7

0.6

5.8

Giberelline

0

0

0

0

11.7

Calcul des volumes à prélever : exemple de l’ANA en P2

[pic 9][pic 10]

- Compléter les erlenmeyers jusqu’à 70mL avec de l’eau distillée

- Ajouter du saccharose et de la gélose :

[pic 11]

Saccharose :

[pic 12]

Gélose :

- Faire bouillir les solutions

- Réduire le chauffage et mélanger jusqu'à dissolution de la gélose

- Répartir chaque milieu dans 3 tubes (20mL) et bien noter le nom du milieu sur chaque tube AU FEUTRE INDÉLÉBILE SUR UN SPARADRAP

- Stériliser à l’autoclave à 1.1 bar, 115°C pendant 20min

- Laisser refroidir en position légèrement oblique

Nous avons rencontré quelques problèmes lors de la création de nos géloses. En effet, celles-ci n’avaient pas pris et le milieu était presque liquide. Nous avons donc du revenir le lendemain pour rajouter de la gélose.

II) Mise en culture des tissus végétaux en conditions stériles

Le travail se réalise sous une hotte à flux laminaire afin de rester en conditions stériles:

[pic 13]

Il faut faire attention à ne pas mettre ses mains au dessus des tubes et des solutions pour ne pas les contaminer. Tous les instruments doivent être désinfectés à l’alcool à 70° après chaque utilisation et il ne faut jamais éteindre le bec électrique. Le matériel végétal est posé sur du papier stérilisé avec le scalpel la pince.

/!\ Bien se laver les mains dès qu’elles sont sorties de la hotte avant de reprendre le travail et ne jamais s’éloigner du bec électrique.

1) Préparation des solutions de stérilisation (hors hotte)

- Préparer 250mL d’hypochlorite de calcium à 50g/L : mélanger l’hypochlorite avec l’eau distillée et agiter pendant 10min. Filtrer sur papier filtre dans un erlenmeyer stérile (sous la hotte !).

- Préparer 250mL d’eau distillée additionnée de Mercryl Laurylé à 10%

- Préparer 50mL de domestos dilué au 1/5

Cette étape a été réalisée par un autre groupe, nous n’avons donc pas réalisé ces manipulations.

2) Prélèvement du matériel végétal (hors hotte)

Prélever :

- une feuille de St Paulia bien verte et parmi les feuilles les plus âgées

- une carotte à peler

- des longs germes de pomme de terre avec 13 bourgeons au total

- les laver à l’eau courante sans les abimer

- découper les germes en portion de trois nœuds

Pour cette étape, il n’y avait pas assez de pommes de terre. Il était donc possible de prendre des feuilles de laurier. Cependant, nous avons réussi à obtenir assez de bourgeons de pomme de terre pour ne pas avoir besoin de laurier.

3) Désinfection du matériel végétal (hotte)

Pomme de terre et carotte :

- Plonger successivement les végétaux dans le Mercryl Laurylé (agiter pendant 1min) puis dans l’hypochlorite de calcium pendant 20min

- Effectuer ensuite 3 rinçages successifs dans l’eau distillée stérile (agiter doucement)

/!\ Bien rincer la pince entre chaque utilisation

Saint Paulia :

- Plonger 20s la feuille dans l’alcool à 70°

- Plonger 12min dans le domestos dilué

- Effectuer 3 rinçages successifs

Les manipulations sont faites en même en même temps afin d’optimiser le temps. Pendant que la carotte et les pommes