Compte rendu CRIPSR

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On peut aussi agir sur cet ARN guide via le choix du promoteur. En effet, la présence du promoteur U6 ou T7 est nécessaire pour la transcription de l'ARN guide via l'ARN polymérase III. Or pour que ces promoteurs soit fonctionnels, il faut rajouter un G en 5' de la séquence à transcrire pour le promoteur U6, et deux G en 5' pour le promoteur T711.

Cela restreint le champ d’action de l’ARN guide aux cibles qui possèdent la forme GN16-19NGG ou GGN15-18NGG.

Pour palier à ce problème, une des solutions trouvées par les chercheurs est de rajouter ces nucléotides en extrémité 5' flanquante sur l'ARN guide. Ainsi la spécificité de cet ARN n'est plus restreinte par l'ajout de ces nucléotides et le promoteur est toujours fonctionnel.

- Modifications de Cas9

Une autre façon de modifier le système CRISPR est d'agir sur la nucléase Cas9. Comme nous l'avons indiquée dans la partie précédente, Cas9 possède deux sites de clivage : HNH qui clive le brin d'ADN complémentaire à l'ARN guide, et RuvC qui clive l'autre brin d'ADN (Figure 4a).

Il est possible d'inactiver un des deux sites de clivage de Cas9 par mutation. On obtient alors une nickase. La mutation D10A au niveau du site RuvC permet l’obtention d’une D10A Cas 9 nickase (Figure 4b). La mutation H840A au niveau du site HNH permet l’obtention d’une H840A Cas9 nickase (Figure 4c).

Le système CRISPR-Cas9 n’est pas hautement spécifique. En effet, son utilisation peut altérer des sites hors-cible. Pour diminuer cela, il est possible d’utiliser les nickases par paire. Par exemple, l’utilisation de deux D10A Cas9 nickase permet d'augmenter la spécificité de Cas9 et donc de réduire les effets hors-cible (Figure 4d).

Il est également possible d'inactiver les deux sites de clivage en même temps. On obtient ainsi une dead Cas9 ou dCas9 (Figure 4e). Ces dCas9 sont notamment utilisées pour réguler l’expression transcriptionnelle d’un gène19.

La dCas9 peut se fixer sur le promoteur du gène cible. Cette fixation va empêcher la reconnaissance du promoteur par les facteurs de transcription et par l'ARN polymérase, ce qui aura pour conséquence d'inhiber l'initiation de la transcription.

Par ailleurs, l'ARN polymérase peut être bloquée par la présence de la dCas9 sur le cadre ouvert de lecture du gène. Elle va alors se décrocher et conduire à l’arrêt de l'élongation de la transcription (Figure 5a).

La dCas9 peut être couplée à des protéines via un système de greffe. Cette construction est utilisée, entre autre, pour activer la transcription d'un gène. La dCas9, fusionnée à des facteurs d’initiation de la transcription va se fixer en amont du promoteur du gène cible et induire son expression (Figure 5b).

Plusieurs modifications peuvent être cumulées sur une même construction. Par exemple, John P Guilinger et al.13 ont utilisés une paire de dCas9 sur lesquelles a été greffé un monomère de la nucléase FokI. Ceci a été réalisé dans le but d'augmenter la spécificité du mécanisme CRISPR par rapport à l’utilisation de nickases par paire. En effet, pour qu'il y ait clivage de l'ADN cible, il faut que les deux dCas9 se fixent à une certaine distance l'une de l'autre pour permettre la liaison entre les deux monomères de FokI qui vont alors être capables de cliver l'ADN (Figure 6).

Malgré cela des phénomènes hors-cible sont toujours observés. Il reste encore beaucoup de progrès à faire dans ce sens avant de pouvoir espérer utiliser le système CRISPR en thérapie génique chez l'Homme.

- HDR et NHEJ

Comme nous l’avons expliqué précédemment, le système CRISPR-Cas9 peut-être utilisé pour reconnaître et clivé une séquence d’ADN spécifique. Une fois l’ADN clivé, deux voies de réparation de l’ADN peuvent intervenir : HDR (Homology-Directed Repair) et NHEJ (NonHomologous End Joining)a. Ces deux systèmes de réparations sont très conservés, on les retrouve de la bactérie à l’Homme.

La voie HDR permet d’effectuer une recombinaison homologue en présence d’une séquence d’ADN « donneur » (Figure 7a). Elle permet aux chercheurs d’insérer précisément une séquence d’ADN (de même taille que la séquence à remplacer) ou d’effectuer une mutation ponctuelle.

La voie NHEJ effectue une réparation aléatoire de l’ADN permettant aux chercheurs d’effectuer de grandes insertions ou délétions de gène ou de groupe de gène (Figure 7b). La taille de l’insertion ou de la délétion est variable.

Au-delà de toutes ces modifications, le système CRISPR peut être utilisé en multiplexing5. Cet outil consiste en l’association d’un ensemble d’ARN guide contenu sur un même plasmide pour conduire au ciblage de différents gènes. Cela est intéressant pour l’étude de famille multigénique.

- Entreprises et Applications

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- CRISPR Therapeutics

CRISPR Therapeuticsb est une entreprise biopharmaceutique Suisse fondée aux alentours de 2009.

Son siège social est à Basel en Suisse et ses opérations s’effectuent à Londres. Elle a été créée pour adapter la technologie révolutionnaire d’édition de gène CRISPR-Cas9 à la médecine avec pour objectif la guérison des maladies génétiques humaines. Cette dernière a su convaincre la société de capital risque Versant Ventures d’investir 25 millions de dollars dans son projet. Fondée en 1999, Versant Ventures investit principalement dans des dispositifs médicaux et des produits biopharmaceutiques novateurs et dans d’autres opportunités se présentant dans le secteur des sciences de la vie.

CRISPR Therapeutics est dirigée par le docteur Rodger Novak (chef de direction) associé à Shaun Foy (gestionnaire). De plus, une équipe comprenant des experts de haut niveau dans divers domaines de la science a été mise sur pied. Cela comprend le mécanisme CRISPR-Cas9, l’édition du génome, la biologie des cellules souches, les technologies d'administration de médicaments de pointe, l’ARN interférence et l’inactivation de gènes.

Les scientifiques fondateurs de CRISPR Therapeutics sont :

- Le Dr Daniel Anderson, professeur au Massachusetts Institute of Technology