Compte Rendu d'enzymologie
Par Matt • 12 Juin 2018 • 2 677 Mots (11 Pages) • 570 Vues
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Cette cuve est notée T0, elle représente l’étude de l’activité de la chymotrypsine au temps 0, autrement dit avant d’avoir été activée. En effet nous n’avons toujours pas ajouté la trypsine, donc elle est encore sous la forme de chymotrypsinogène.
Remarque : avant de réaliser les mesures on étalonne le spectrophotomètre avec le « blanc » composé de tampon d’activité et de DMSO.
Ainsi nous avons obtenu les absorbances suivantes :
Tps(sec)
0
15
30
45
60
75
90
105
120
Abs
-0.005
-0.005
-0.005
-0.005
-0.005
-0.004
-0.004
-0.004
-0.004
Les absorbances sont proches de 0, notre chymotrypsine est bien sous la forme inactive pour le moment.[pic 9]
Etape 4 : On ajoute 100 µL de trypsine dans la solution contenant le chymotrypsinogène.
Comment avons-nous calculer le volume de trypsine à ajouter ?
Nous voulons ajouter un certain volume de trypsine pour obtenir 1% de trypsine massique par rapport au chymotrypsinogène.
mtrypsine / m chymotrypsinogène = 1 % soit 0,01
mtrypsine / 20 mg = 0,01
mtrypsine = 20 x 0,01 = 0,2 mg
0,2 mg de trypsine sont nécessaires à la manipulation, nous avons une solution de trypsine à 2 mg/mL, calculons donc le volume à ajouter :
2 mg → 1 mL
0,2 mg → V
V = (0,2 x 1) / 2 = 0,1 mL soit 100 µL
Une fois la trypsine ajoutée, on déclenche le chronomètre, l’activation de la chymotrypsine est alors lancée.
Etape 5 : Au bout de 5 min, on prélève 10 µL de notre mélange d’activation que l’on introduit dans une cuve contenant 2,7 mL de tampon d’activité et 0,3 mL de substrat Bz-Y-pNA.
Etape 6 : On mesure l’absorbance de la cuve pendant 2 minutes en relevant les valeurs toutes les 15 secondes
Voici alors ce qu’il se passe à l’intérieur de la cuve :
[pic 10]
La chymotrypsine va catalyser son substrat spécifique (Bz-Y-pNA), une fois catalysé on obtient deux produits dont le pNA qui absorbe à 410 nm. Les absorbances obtenues sont alors l’absorbance de ce produit et comme celui-ci est catalysé par la chymotrypsine on observe indirectement l’apparition de chymotrypsine.
Cette étape-là doit être faite plusieurs fois afin d’avoir le maximum de chymotrypsine. Ainsi on renouvelle cette manipulation jusqu’à obtenir des absorbances stables.
Dans ce tableau on retrouve nos relevés d’absorbance
T=0
T=15
T=30
T=45
T=60
T=75
T=90
T=105
T=120
T5min
0,004
0,014
0,022
0,035
0,046
0,058
0,069
0,081
0,092
T10min
0,001
0,008
0,028
0,042
0,056
0,071
0,087
0,102
0,118
T15min
0
0,012
0,027
0,039
0,053
0,067
0,082
0,096
0,110
T20min
0
0,002
0,013
0,029
0,040
0,054
0,069
0,082
0,098
T25min
0
0,004
0,016
0,029
0,042
0,050
0,070
0,084
0,097
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