Activation et analyses enzymatique de la chymotrypsine.

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Elimination de la trypsine

Une fois l’activité chymotrypsique maximale obtenue, nous avons procédé à la purification de la solution par chromatographie d’affinité.

Le gel contenu dans la colonne était un gel de sépharose activé au bromure de cyanogène et couplé à un ligand spécifique de la trypsine active : la p-aminobenzamidine. Nous avons déposé la chymotrypsine activée dans la colonne et nous avons élué la chymotrypsine avec 5 mL de tampon d’élution (Tris HCl 50 mM pH 8.0, KCl 500 mM, CaCl2 20 mM).

Nous avons ainsi recueilli 7 fractions de 1 mL de chymotrypsine active débarrassée de la trypsine. Une fois la chymotrypsine recueillie, nous avons régénéré le gel de chromatographie en éluant la trypsine en déposant 10 mL de solution d’élution de la trypsine, puis en déposant 10 mL de tampon d’élution du chymotrypsinogène (Tris HCl 50mM pH 8.0 ; KCl 500 mM, CaCl2 20mM).

Test de l’activité de la chymotrypsine

L’absorbance à 280nm de chacune des fractions a été mesurée par spectrophotométrie. Pour cela, dans chaque cuve nous avons déposé :

2.7mL de tampon d’activité (Tris- HCl 50 mM pH 7.5 ; NaCl 100 mM)

300 µL de Bz- Y-pNa à 2 mM

1 mL de fraction de chymotrypsine active

Les fractions contenant la chymotrypsine ont été regroupées, pour constituer notre pool chymotrypsine, que nous avons conservé dans la glace, après avoir déterminé son absorbance à 280 nm et sa concentration (et nous avons conservé un aliquot de 30 µL de ce pool de chymotrypsine).

Analyse de la chymotrypsine par électrophorèse

Préparation des gels d’électrophorèse

Nous avons dû préparer les gels d’électrophorèse pour l’analyse de la chymotrypsine par électrophorèse. Pour cela, nous avons dans un premier temps préparé le gel de résolution dont le rôle est de séparer les protéines, nous avons réalisé un mélange contenant :

7.5 mL de solution pour gel de séparation

90µL de persulfate d’ammonium 10%

5 µL de TEMED

Sans attendre (pour éviter une polymérisation hors du support du gel), nous avons rempli, à l’aide d’une pipette pasteur, l’espace entre les plaques de verres et nous y avons ajouté une fine couche d’eau.

L’eau nous a servi à vérifier la polymérisation du gel inférieur.

Une fois le gel de résolution polymérisé, nous avons préparé le gel de concentration, pour cela nous avons réalisé le mélange suivant :

3.5 mL de solution pour gel de concentration

70 µL de persulfate d’ammonium 10%

5 µL de TEMED

Comme pour le premier gel, nous avons rempli, rapidement, l’espace entre les plaques de verre, à l’aide d’une pipette Pasteur. Le peigne permettant la formation des puits a ensuite été installé. La plaque de gel a ensuite été mise en place sur son support, puis nous avons rempli la cuve de tampon de migration.

Préparation des échantillons

Nous avons dû analyser les échantillons de chymotrypsinogène et de pool chymotrypsine en conditions dénaturantes en absence et en présence de DTT. Ainsi, nous avons préparé 4 tubes différents contenant :

1° : 15µL de TD + 15µL de chymotrypsinogène

2° : 15 µL de TD-DTT + 15 µL de chymotrypsinogène

3° : 15µL de TD + 15µL de chymotrypsine (pool)

4° : 15µL de TD-DTT + 15µL de chymotrypsine (pool)

Ces échantillons ont été chauffés pendant 2 minutes à 90°C dans le but de dénaturer les protéines.

Dépôt des échantillons

Une fois les échantillons prêts nous avons déposé :

Dans le premier puits : 5 µL de la solution de protéines de référence (témoin de la migration)

Dans les puits suivants : 20 µL de chacun des échantillons

L’électrophorèse a ensuite été effectuée pendant 45 minutes à 50 mA. Une fois l’électrophorèse terminée, nous avons vidé le tampon de migration puis démoulé le gel.

Coloration

Le gel a été coloré au bleu au Coomassie : 50mL de solution de coloration ont été déposés dans une boîte en plastique où nous avons ajouté le gel, que nous avons laissé incuber pendant 15 minutes à 60°C.

Décoloration

Pour décolorer le gel, la solution de coloration a été récupérée dans son flacon, nous avons ensuite laver la boîte à l’eau 3 fois. Après avoir rempli d’un petit volume d’eau, nous avons laissé le gel décolorer dans une solution de décoloration fournie, toute une nuit.

Deuxième jour

2-1) Analyse enzymatique de la chymotrypsine

Sans inhibiteur

Pour analyser l’activité enzymatique de la chymotrypsine que nous avons activée, nous avons d’abord procédé à une spectrophotométrie sans inhibiteur. Dans cette expérience nous avons fait varier les concentrations de substrat (Bz-Y-pNa) de 0.02 mM à 0.2 mM. Pour obtenir une répartition homogène des inverses des concentrations de substrat nous avons procédé comme ceci :

Essai 1/[S] mM-1 [S] mM

1 50 0.02

2 38.75 0.026

3 27.5 0.036

4 16.25 0.061

5 5 0.2

(1/S1- 1/S5)/(nbr d’intervalles)=(1/0.02- 1/0.2)/4=11.25

Pour connaître le volume de substrat à mettre dans chaque tube, nous avons calculé :

C1 x V1=C2 x V2 Avec

C1 = concentration initiale de Bz-Y-pNa

C2