Partiel Biochimie-Réactions Cellulaires

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La chromatographie échangeuse de cations est une méthode de purification basée sur la séparation des molécules selon leur charge globale. La colonne est constituée d’une matrice sur laquelle sont greffés des groupements ionisables chargés négativement au pH de travail. Cette matrice sera donc capable de retenir des molécules chargées positivement (cations). Dans le cas des protéines elles seront chargées positivement si leur pHi est supérieur au pH de travail. Les protéines chargées positivement seront retenues sur la colonne alors que les protéines neutres ou chargées négativement ne seront pas retenues et seront éluées en premier. Pour éluer les molécules positives retenues sur la colonne, il faut appliquer un gradient de force ionique (NaCl par exemple) ou l’ion Na+ jouera le rôle d’un compétiteur. On peut aussi utiliser un gradient de pH croissant.

La chromatographie d’exclusion est une méthode de séparation des molécules selon leur taille. La colonne est composée de billes poreuses. Les molécules de taille supérieure au diamètre des pores des billes ne rentrent pas dans les billes et sont entrainées par le tampon d’élution. Les molécules de taille inférieure au diamètre des pores des billes vont pouvoir entrer dans les billes et seront donc ralenties lors de l’élution. Par conséquent, lors de la chromatographie d’exclusion, les plus grosses molécules sont éluées en premier et les plus petites en dernier.

1b. Donner le principe de l'électrophorèse

L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules sous l’effet d’un champ électrique. Dans le cas des protéines, l’électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide constitué d’un réseau de maille plus ou moins large dans lequel les plus grosses molécules sont freinées par rapport au plus petites. La séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dépend donc de la charge et de la taille des protéines. En conditions dénaturantes, on utilise du β-mercaptoéthanol ou du dithiothreitol (DTT) qui permet la coupure des ponts disulfures et du sodium dodecyl sulfate (SDS) qui entoure les protéines de charges négatives. En condition dénaturantes, les protéines chargées négativement se déplaceront toutes vers l’anode et leur séparation sur le gel dépendra uniquement de leur taille.

1c. Compléter le tableau 1 bilan de purification.

Le rendement de purification correspond au rapport de la quantité de α-DsbA1 totale finale sur la quantité de α-DsbA1 totale initiale.

Le degré de pureté de α-DsbA1 correspond au rapport de la concentration de α-DsbA1 sur la concentration de protéine totale.

Le facteur de purification correspond au rapport du degré de pureté final sur le degré de pureté initial.

Le rendement et le facteur de purification peuvent être calculés pour chaque étape et globalement.

Etape de purification

Concentration protéine totale (mg/mL)

Volume total

(mL)

Concentration de

α-DsbA1

(mg/mL)

Rendement purification de α-DsbA1

(%)

Degré de pureté de α-DsbA1

(%)

Facteur de purification

Lysat

9,3

100

1,1

-

1,1/9,3=0,1183 soit 11,83%

-

Echangeur cations

3,5

8

2,4

2,4*8/1,1*100=

0,1745 soit 17,45%

2,4/3,5=0,8657 soit 68,57%

68,57/11,83= 5,8

Chromato. exclusion

3,8

4,8

3,8

3,8*4,8/2,4*8=0,95 soit 95%

Global: 16,58%

3,3/3,8= 1 soit

100%

100/68,57=1,46

Global: 100/11,83=8,45

1d. Analyser le tableau 1 bilan de purification et les gels d’électrophorèse

Pour le tableau: à l'issue des 2 étapes, nous obtenons la protéine purifiée 8,45 fois avec un rendement de 16,6%. Nous constatons que si la chromatographie échangeuse de cations permet une purification de 5,8 fois le rendement est assez faible (17,45 %). Le rendement de la chromatographie d'exclusion est excellent (95%) mais le facteur de purification n'est que de 1,46. Il est possible qu'il ne puisse pas être plus élevé si a cette étape la protéine est pure.

Pour les gels. Si on compare les pistes 1 (lysat contenant la protéine d'intérêt) et 2 (lysat n'exprimant pas la protéine d'intéret) du gel A, on note une similitude au niveau des nombreuses bandes protéiques sauf pour une protéine d'environ 24000 Da (en comparant avec les marqueurs de la piste 3) qui est plus intense dans la piste 1. Il s'agit probablement de notre protéine α-DsbA1. Dans le gel B, la piste 2 (étape chromatographie échangeuse de cations) révèle la présence d'une protéine très majoritaire d'environ 24000 Da, identique à celle retrouvée dans la piste 1. Néanmoins nous retrouvons des traces de protéines de plus haut poids moléculaire indiquant que la protéine de 24000 n'est pas pure à cette étape. Par contre dans la piste 3 (étape chromatographie exclusion), nous ne voyons plus qu'une seule bande à 24000Da suggérant en accord avec les valeurs du tableau