Méthodes biochimiques, la purification des protéines.

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- LA DIALYSE

C’est une technique qui permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane dont les dimensions sont inférieures aux dimensions macromoléculaires (cellophane, nitrocellulose, taille des porcs permet le passage de molécules de poids moléculaires jusqu’à 50 000 da : cut-off 50 kDa).

[pic 4]

Le système :

- Un sac de dialyse

- Les molécules à séparer

- Un liquide de contre-dialyse

[pic 5]

A t=0min, les deux types de molécules sont dans le sac de dialyse

A l’équilibre, pour les petites molécules, la concentration à l’intérieur = concentration à l’extérieure.

Si le volume de contre-dialyse est suffisant, les petites molécules sont suffisamment diluées → concentration dans le sac de dialyse peut alors devenir très faible.

Afin d’accélérer le processus, il vaut mieux changer souvent le liquide de contre-dialyse pour du nouveau liquide plutôt que d’utiliser une seule quantité (même grande) de liquide.

Utilisation pour :

- L’élimination de petites molécules d’un extrait biologique

- Le dessalage (élimination des sels d’une solution)

- Les changements de solution tampon

- MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES

Ce terme désigne un ensemble de méthodes de séparation basées sur différents principes physiques. Ces méthodes ont en commun un support qui peut être :

- Une poudre très fine qui grâce à ses nombreux grains possède une grande surface

- Un solide percé de fins canaux dont la surface interne est importante

Les molécules à séparer sont dissoutes dans un solvant convenable. La solution est ensuite déposée sur la support. Il se produit des réactions de fixation molécules-support et dont la force dépend à la fois du type de support choisi et des propriétés physico-chimiques des molécules à séparer.

Une 2ème solution passe à travers le support qui va entraîner certaines molécules plus vite que d’autres permettant leur séparation.

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1. Chromatographie sur papier

Elle utilise une feuille de papier-filtre maintenue verticalement dans une enceinte fermée.

- La feuille plonge par son bord inférieur dans un mélange de solvants polaires et organiques

- Echantillon est déposé à quelques cm du bord de la feuille

- Le mélange de solvants migre alors par capillarité en entraînant les substances contenues dans l’échantillon à des vitesses différentes.

Séparation pour une chromatographie sur papier

Les différences de vitesse de migration sont dites :

- à la partie polaire du mélange de solvants qui inhibe la feuille retenant les substances polaires

- à la phase organique qui continue à migrer entraînant les substances non polaires

La séparation des constituants dépend donc de leurs solubilités relatives dans la phase polaire phase stationnaire) et la phase apolaire ou peu polaire (mobile). Moins les molécules sont polaires et plus vite elles se déplaceront sur la feuille et inversement.

Caractérisation des positions repérées après migration

La position de chaque tache est caractérisée par une grandeur Ri :

Ri = distance parcourue par le soluté / distance parcourue par le solvant = x / y

Pour un mélange de solvants et un support chromatographique donnés, chaque substance est caractérisée par sa constante de migration Ri.

2. Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur papier a été supplantée par la CCM qui conserve beaucoup de ses particularités mais permet des applications plus vastes.

Le support est déposé sur une plaque rigide (verre, plastique) qui peut être :

- De la cellulose

- De la silice

3. Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne en phase liquide nécessite l’utilisation d’un cylindre de verre placé verticalement. La colonne est remplie avec le support (lequel est retenu par un filtre). Le mélange à séparer est déposé en sommet de la colonne. Les substances à séparer se fixent sur le support, on s’échange avec le solvant qui l’imprégnait (phase stationnaire).

On dépose ensuite un autre solvant (phase mobile) qui lave (élue) la colonne et entraîne les substances à séparer à une vitesse qui dépend de leurs propriétés physico-chimiques. Le liquide récupéré au bas de la colonne est appelé éluat.

Rq : L’opération peut être conduit à basse, moyenne ou haute pression (atmosphérique, 10 ou 30 bars)

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4. Chromatographie par échange d’ions

[pic 6]

Le support, déposé dans une colonne placée verticalement, est constitué d’un polymère organique ou glucidique auquel sont liés des groupes :

-Chargés négativement : échangeur de cations (sulfonate SO3-, carboxylate COO-) -Chargés positivement : échangeur d’anions (amines tertiaires NHR2, quaternaires NR3+)

Les molécules accrochées au support peuvent être décrochées par augmentation de la force ionique de la solution de lavage ou par variation de son pH. La séparation améliorée lorsqu’on fait varier une de