Fractionnement cellulaire et mise en évidence de réactions d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire.

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-La cuve 3 ; contenant les mêmes éléments que dans la cuve 2, le cyanure en moins.

/!\ La fraction mitochondriale et à rajouté plus tard dans le cuves.

Le cyanure nous sert à inhiber le complexe IV de la chaine respiratoire. Si le complexe IV est inhibé, il ne joue plus son rôle d'accepteur d'électrons. C'est toute la chaîne respiratoire qui s'arrête, il n'y a plus de production d'ATP, les cytochromes C réduit s’accumulent, et l’oxygène n’est plus converti en eau.

L’évolution de la réaction est plus facilement observable à 550 nm car le cytochrome C est le seul à absorber cette longueur d’onde.

L’accumulation du cytochrome C réduit augmente bien évidement sa concentration, et donc son absorbance à 550 nm.

Nous ajoutons du cytochrome C oxydé en plus pour en avoir une quantité suffisante en solution pour la réaction.

Nous ajoutons du succinate qui sera transformé en furamate.

On dilue le tout dans un tampon phosphate.

La cuve 3 nous servira de cuve témoin, qui nous montrera ce qui se passe sans inhiber le complexe IV.

Avant chaque mesure, nous devions réchauffer la cuve dans nos mains pour lancer la réaction, car les cuves étaient placées dans la glace, et ajouter la fraction mitochondriale (1 mL).

La cuve va rester 20 min dans le spectrophotomètre qui, relié à un ordi, va permettre de dresser un tableau d’absorption pour tracer une courbe d’absorption au cours du temps.

Réaction schématisant la réaction des électrons par le complexe IV est schématisé par les réactions de l’activité succinate-cytochrome C réductase par la formule :

SUCCINATE + OXYGENE => FUMARATE + H2O

Résultats & Discussion :

Observation :

Courbe 1 (cuve 2) : Nous observons que la courbe semble quasi croissante de 0 à 20 min. L’absorbance passe de 0,185 à 0,888. Il semble y avoir un plateau d’absorbance à 0,9.

On distingue une première partie où la courbe évolue de manière exponentielle de 0 à 3min et une seconde où la courbe est quasi constante de 3 à 20min (Légère dévolution de 3 à 8min puis légère évolution de 8 à 20min).

Courbe 2 (cuve 3) : Nous observons que la courbe semble quasi décroissante. L’absorbance passe de 0,088 à 0,021. Il semble y avoir un plateau d’absorbance à 0,01.

C’est de 0 à 3min que la variation de la courbe est plus importante. Ensuite la courbe est quasi constante, avec une légère baisse de 3 à 8min, puis une légère hausse de 8 à 20min.

Analyse :

Cuve 2 :

-l’absorbance en augmentation signifie qu’il y a de plus en plus de cytochrome C réduit dans la cuve.

-l’augmentation de la vitesse de réduction du Cytochrome nous indique que l’activité succinate-cytochrome C réductase a encore lieu.

-A l’instant t=3min, au moment où la vitesse est maximale, les complexes IV des mitochondries ont été désactivé par le cyanure. Le cytochrome C est réduit par les complexes II et III, mais l’inhibition du complexe IV fait qu’ils atteignent leur charge maximale.

La fraction mitochondriale est devenue le réactif limitant.

-La légère décroissance est dut à des éléments autres que les mitochondries qui passe devant le faisceau lumineux ; cela montre que la fraction n’est pas pure.

=> l’allure de la courbe est les valeurs d’absorbances semble indiqué que la manipulation est réussite, malgré une trop forte absorbance à t=0, du fait que l’on n’a pas fait la spectrophotométrie assez rapidement. Le blanc quant à lui semble être correct.

Cuve 3 :

-L’évolution de l’absorbance devrait être a peu près constante en tant normal, mais celle si diminue dut à une fraction mitochondriale non pure. Des petites particules présentent à cause d’une mauvaise purification se serait donc s’aggloméré pour former des floculas.

-la très légère croissance de la courbe pourrait s’expliquer par une mauvaise homogénéisation de la solution. On en déduirait que la réaction de réduction est plus efficace que celle d’oxydation du cytochrome C, dût probablement à une plus forte présence de succinate que d’oxygène.

Conclusions :

En conclusion, le TP nous a permis de mettre en évidence le rôle de la mitochondrie et le fonctionnement de la chaîne respiratoire ainsi que l’activité succinate-cytochrome C réductase, grâce à la centrifugation différentielle et la spectrophotométrie.

De plus, après que le complexe IV ait été inhibé, la quantité de cytochrome C réduit a augmenté, et nous dévoile donc les réactions d’oxydo-réduction présent au sein de la cellule.

Nous avons rencontré des problèmes de floculation lors de la spectrophotométrie dut probablement à une mauvaise homogénéisation de la solution qui ont parasité les résultats, mais les résultats semble tout de même plus que convenable.

[pic 6]

[pic 7][pic 8]