Extraction de caséine

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Réalisation et révélation de la CCM de partage :

L'éluant est composé de 1/6 d'eau, de 1/6 d'acide acétique et de 4/6 de butanol. Chaque acides aminés connus a été déposé sur la ligne de dépôt de la plaque. Les deux hydrolysats de tripeptides ont été déposés deux fois chacun. La plaque réalisée est ensuite placée sous une hotte aspirante. Un fois que le front de l'éluant a été atteint (7,5cm), on a révélé la chromatographie. Pour cela, une solution de ninhydrine à 0.2% dans un mélange d'éthanol et d'acide acétique a été pulvérisée sur la chromatographie. Celle ci a ensuite été séchée dans une étuve à 80°c. Afin d'identifier les acides aminés composant la caséine, nous avons utilisé le Rf qui permet de comparer les migrations entre les 2 tri-peptides utilisés et les 14 acides aminés que nous possédons.

Résultats :

- Isoler les caséines, protéines présentes dans le lait de vache :

J'ai obtenue 0.7 gr de caséines. Donc la caséine à une Cmassique = 0.7/20 (car 20 mL de lait utilisé ) = 35 gr.L La valeur théorique est de 28gr.L. J'ai eu un rendement de 125 % car (35/28)*100=125%.

Nous avons obtenue une gamme. Nous avons pu tracer la courbe étalon qui lui est associée grâce aux mesures de l'absorbance. On a reporté les valeurs d'absorbance des trois échantillons d'hydrolisats sur le graphique.

Détermination de la concentration en caséine :[pic 1]

On a calculé le nombre de mL de tyrosines libres présent dans la solution 6 car cette solution ne rentre pas dans notre courbe étalon. On a utilisé la loi Beer-Lambert : A = k*C.

C = A/K ; K étant le coefficient directeur de la courbe étalon. En traçant une courbe de tendance, on a obtenue K = 0,2757142857.

Donc C= 0,39/ 0,2757142857 = 1,4145.10-3 mL de tyrosines libres dans la solution 6 soit Cmassique tyrosines libres = 7,0725.10-2 g.L car le facteur de dilution est de 50. On en a déduit Cmassique tyrosine totale = 1,7681.10-1 g.L et donc Cmolaire tyrosine totale = 9,7686.10- 4 M. On divise par 3 ( il y a 3 tyrosines par caséine ) pour avoir Cmolaire caséine= 3,25.10-4 M soit Cmassique caséines= 8,1405 gr.L. La valeur théorique est de Cmassique caséine = 9 gr.L. On a donc un rendement de : R = 90,45%

- Détermination des acides aminés contenus dans la caséine :

[pic 2]

Acides aminés

Leu

Pro

Gly

Ala

Cys

Glu

Lys

Gln

Mel

Hus

Phe

Asn

Rf

0.56

0.29

0.666

0.16

0.173

0.106

0.866

0.04

0.427

0.066

0.493

0.053

Tripeptides

MD1 Tâche 1

MD1 Tâche 2

MD2 Tâche 1

MD2 Tâche 2

Rf

0.013

0.333

0.04

0.133

On en a déduit que le tripeptide MD1 contient les acides aminés Asn, Leu et Phe et le tripeptide MD2 contient les acides aminés Pro, Ala et Gln car les rf entre les tripeptides et ces acides aminés sont proches. Un tripeptide est une liaison peptidique contenant 3 acides aminés.

Discussion :

- Isoler les caséines du lait :

Nous avons obtenue un rendement de 125%. On constate que ce rendement est anormal car il est supérieur à 100% (dans ce cas, l'expérience aurait été parfaite). Ce résultat n'est pas conforme avec ce que nous attendions car il n'est pas pertinent. Nous aurions souhaité un rendement compris entre 90% et 100%. Cette singularité peut être expliquée par le fait que la caséine extraite n'est pas pure. C'est peut être la précipitation isoélectrique qui a mal marché : le pH a pu ne pas être exactement à 4,6 donc d'autres molécules ont pu s’agglomérer aux caséines Il se peut aussi que nous ayons mal éliminé le surnageant après la précipitation, donc il reste d'autres entités dans le tube. Le précipité obtenue n'a peut être aussi pas assez séché, alors il reste encore de l'eau, ce qui fait que le précipité est plus lourd quand on le pèse. Nous aurions pu, à la place d'une précipitation isoélectrique, utiliser une précipitation par les sels. Cette méthode consiste à ajouter du sulfate d'ammonium à forte concentration pour éliminer l'eau et donc précipité les caséine. La précipitation par l'alcool aurait pu aussi être une possibilité. Une autre méthode possible est de faire une chromatographie par échange d'ion (voir image 1 de l'index). A pH = 6,5, les caséines ont une charge négative. Par contre, si d'autre molécules sont chargées négativement, elles s’accrocheront aussi aux charges positives. Cette technique est intéressante si on l'utilise pour purifier les caséines après la précipitation isoélectrique afin qu'il n'y est que des caséines.

- Détermination de la concentration en caséine dans une solution :

Les résultats obtenues semblent corrects. La solution 6 contient, d'après la loi de Beer-Lambert, 1,4145.10-3