Etud edes conséquences de la rupture d'adhésion sur les cellules 3T3 et CHO
Par Ninoka • 18 Septembre 2018 • 4 084 Mots (17 Pages) • 543 Vues
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Les cellules arrondies sur les photos sont des cellules en rupture d'adhérence, soit à cause du milieu, soit parce qu'elles sont en cours de division. Leur densité permet d'estimer la capacité proliférative des cellules dans les conditions d'adhérence.
Les photos permettent d'estimer la densité cellulaire (voir Fig.1).
Pour les cellules 3T3, la densité observée est croissante en condition P et RP. La densité est supérieure à 90 % pour le J3 de la condition P, les cellules sont à confluence. Concernant la condition M, la densité reste sensiblement identique, avec une légère diminution en J3. Pour les cellules CHO, la densité est croissante en condition P et RP, la confluence n'est cependant pas atteinte en J3 de la condition P. Pour les conditions M, la formation d'amas de cellules de plus en plus volumineux est observée.
Ces images donnent également une idée de la capacité de prolifération des cellules, notamment dans les conditions P et RP : l’analyse de la densité des cellules montre que les cellules CHO présentent plus de cellules en cours de mitose que les cellules 3T3 dans les conditions P et RP. En condition M, les cellules sont toutes en rupture d'adhérence, il n'est donc pas possible de conclure sur la prolifération cellulaire.
Pour vérifier la représentativité de ces photos, les densités moyennes ont été calculées chaque jour par comptage sur cellule de Malassez.
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[pic 5]
Les cellules CHO ont un temps de génération moins long, et continuent de proliférer en rupture d'adhérence contrairement aux cellules 3T3.
Pour les cellules 3T3 : le temps de génération en condition P est d'environ 34 heures. Le temps de génération en condition M est négatif, celui en condition RP est plus long (63 heures) mais semble revenir progressivement à celui des conditions P.
Pour les cellules CHO : le temps de génération en condition P est d'environ 22 heures, soit un temps plus court que pour les cellules 3T3. Le temps de génération en condition M est plus long (29 heures), mais reste positif. Le temps de génération en condition RP est plus court (19 heures) que celui en condition P et revient progressivement à la normale.
Les cellules CHO prolifèrent en rupture d'adhérence
L'étude des cellules par cytométrie en flux permet d'observer la répartition des cellules selon la phase du cycle cellulaire (voir Fig.2).
Pour les cellules 3T3 : la majorité de cellules observées sont en phase G1/G0, quelles que soient les conditions d'étude. En P1/P2, une augmentation des cellules en phase S et G2/M est observée. En P3, la quasi-totalité de cellules est en phase G1/G0. Dans les conditions méthocel, une augmentation du nombre de cellules en apoptose et une augmentation des cellules en S/G2/M sont observées. Le profil en RP est comparable au profil en condition P.
Pour les cellules CHO : en condition P, toutes les phases du cycle sont représentées, avec peu de variation au fil des jours. En condition M, une diminution des cellules en phase S et une augmentation des cellules en apoptose par rapport à la condition P sont observées. La condition RP montre un retour à un profil proche de la condition P.
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Les cellules CHO synthétisent de la cycline D1 en toute circonstance
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Grâce au Western Blot, la présence de cycline D1 est observée (voir Fig.3). Deux bandes sont observées, correspondant aux formes phosphorylées et non phosphorylées de la cycline D1. Pour les cellules 3T3, la cycline D1est absente en P0, M1, M2, M3. La cycline D1 est présente dans les puits P1, P2, RP1 et RP2 et dans une moindre mesure dans le puit P3. Pour les cellules CHO, La cycline D1 est présente quelles que soient les conditions de culture et la durée de culture, avec une intensité plus importante pour les conditions P1, P2, P3, RP1 et RP2.[pic 19][pic 20]
La cycline D1 est localisée dans le noyau
L'imagerie par immunofluorescence montre une localisation nucléaire de la cycline D1 à la fois chez les cellules 3T3 et CHO en condition P et RP. En condition M, la cycline D1 disparaît chez les cellules 3T3 mais continue d'être synthétisée par les cellules CHO. L'intensité est nettement supérieure chez les cellules CHO que chez les cellules 3T3 (voir Fig.4).
B
Cycline D1
Noyau
P2
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[pic 22]
M2
[pic 23]
[pic 24]
RP2
[pic 25]
[pic 26]
A
Cycline D1
Noyau
P2
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M2
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RP2
[pic 31]
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Le cytosquelette d'actine et les microtubules sont désorganisés en rupture d'adhérence
L’imagerie montre une organisation des microfilaments d’actine en fibres de stress dans les conditions P et RP pour les 2 types de cellules (voir Fig.5). Les microtubules présentent un aspect en asters polarisés depuis le centrosome dans ces mêmes conditions. Des contacts focaux sont observés dans ces conditions, et sont plus
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