Étude des interactions et des variabilités symbiotiques entre les légumineuses et les rhizobiums

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Pour chaque plantes, il faut identifier le symbiovar de nodosités. Ce sont des données indépendantes car il s'agit de deux événements d'infections différents. Tout d'abord il faut créer les tableaux de contingences des nodosités a et b. A partir de ces tableaux, il faut construire un autre tableau de contingence en faisant la somme des deux nodosités pour chacune des espèces. Si le nombre de colonnes dans les deux tableaux ne sont pas identiques alors il faut forcer le logiciel R à changer les modalités des tableaux pour qu'elles soient les mêmes.

Conditions du test

La première condition est que l'effectif doit être supérieur à 20. Ici, l'effectif est de 432 mais si H0 est vérifié il faut connaître les effectifs. La deuxième condition est la règle de Cochran: pas plus de 80% des cases du tableau des effectifs théoriques doivent être inférieure à 5. Si cette condition n'est pas remplie, il faut réaliser des regroupements de classes. Pour ce faire, il faut regrouper les symbiovars les plus proches phylogénétiquement pour former des clades pertinents pour le test. Après avoir fait les regroupements, il faut les définir pour que R puisse les utilisés et créer deux colonnes dans l'objet R «sitesABC» avec les clades des nodosités a et b. Pour voir si la deuxième condition est remplie, il faut reconstruire un tableau de contingence avec la variable espèce et les deux nouvelles variables et reproduire le tableau des effectifs théoriques. Si les deux conditions du test sont remplies, le test peut être alors réalisé. Le seuil risque étant de 5%.

Pour répondre à la question «toutes les espèces sont-elles autant colonisés par les bactéries les unes que les autres», nous allons utiliser les données des sites A, B et C. L'échantillon n°86 ayant un poids de masse fraîche racinaire trop faible, il ne sera pas utilisé durant cette étude.

Test de l'ANOVA

Notre objectif est de vérifier que plusieurs échantillons sont issus d'une même population. Avant de commencer le test, il faut réaliser une transformation logarithmique sur la variable «nombre de nodosité par gramme de racine fraîche» ce qui augmente les écarts entre petites valeurs et réduits les écarts entre grandes. Cette transformation a pour effet de stabiliser la variance et de normaliser les distributions. L'ANOVA permet d’établir l'effet d'une espèce sur le nombre de nodosité par gramme de racines avec comme variable indépendante la fonction logarithmique du nombre de nodosité par gramme et comme variable explicative l'espèce. De plus, une analyse graphique d'un box-plot exposant le nombre de nodosité (par gramme de masse fraîche racinaire) en fonction des espèces permet de déterminer quelles paires d'espèces (légumineuse/rhizobium) diffèrent significativement l'une de l'autre.

Conditions du test

Les deux conditions sont la normalité des résidus et l’homoscédasticité des échantillons. Deux tests sont alors utilisés pour les vérifier la validité de ces conditions:

- Shapiro-wilk qui a pour l'hypothèse nulle (Ho) que les échantillons x1, ..., xn soit issus d'une population normalement distribuée. Puis,

- Breusch-Pagan qui permet de tester l'hypothèse d'homoscédasticité du terme d'erreur d'un modèle de régression linéaire. L'hypothèse nulle (Ho) posée est que les variances sont homogènes au sein des différentes espèces et l'hypothèse alternative (H1) est que les variances ne sont pas homogènes (hétéroscédascticité).

Le logiciel RStudio est utilisé pour procéder aux différents tests statistiques et pour élaborer les graphiques présenter. Le seuil risque est de 5%.

III - Résultats

Résultats de la PCR et de la RFLP

[pic 1]

Fig.1- Électrophorèse des produits PCR nodC (amorces CF et CR) sur gel d’agarose à 1%

Les bandes à forte intensité sont les produits PCR. Ainsi, la PCR a marché pour tous les échantillons. Le gène NodC est présent dans tous les nodules des échantillons étudiés. De plus, le choix des amorces est validé puisque l’amplification de l’ADN a fonctionné.

PCR ND M N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8

[pic 2][pic 3]

Fig.2- Électrophorèse des produits de digestion par MspI de ces produits PCR sur gel d'agarose à 1,5%.

D’après ces résultats, cinq symbiovars différents peuvent être identifiés grâce à la technique RFLP. En effet, cette dernière permet de comparer les polymorphismes des fragments d’ADN de chaque nodosité échantillonnée. Ainsi, l’ADN des nodosités n’est pas identique. Il y a donc une symbiose spécifique entre légumineuse et rhizobium

Résultats du premier test effectué: le Chi²

Les conditions pour le test du Chi² d'indépendance sont remplies au vu des résultats affichés dans le tableau des valeurs théoriques réalisé après regroupement par clades (Tab.1). Les résultats du test sont X-squared = 1272.649, df = 15, p-value

En effet, p-value étant significativement inférieur à 5%, H0 est rejeté. L'analyse mené a donc permis de démontrer qu'il y a une étroite association entre les symbiovars et les espèces de plantes et par conséquent, une spécificité dans cette interaction symbiotique.

clade I

clade II

clade III

clade IV

Lathyrus_pratensis

24

12,333

24

11.667

Lotus_corniculatus

24

12,333

24

11.668

Medicago_lupulina

24

12,333

24

11.669