Technique d'extraction

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Marquage ARN (ribosonde) : dénaturation ADN matrice -> polymérisation brin ARN complémentaire via ARN pol avec ribonucléosides triphosphates marqués -> élimination ADN via DNase I = ARN marqué sb.

Hybridation en phase liquide

Caractérisation ADN par cinétique de réassociation. Plus la séquence est complexe et grande (ADN codant) plus l’hybridation est difficile.

Hybridation sur support solide

Southern Blot :

- L'ADN est digéré par les enzymes de restriction.

- (Les différents fragments d'ADN résultants de la digestion sont mis en présence de BET)

- Séparation des fragments digérés par électrophorèse.

- (A cette étape on peut vérifier sous UV si les fragments d'ADN ont migré sur le gel, et si les éventuelles prévisions sur leur migration sont conformes.)

- Le gel d'électrophorèse est ensuite trempé dans une solution alcaline (soude) afin de permettre la dénaturation de l'ADN bicaténaire.

- Transfert ADN sur membrane placée sur le gel par pression et capillarité via solution saline.

- fixation de manière permanente l'ADN sur la membrane (chauffage ou UV).

- Pré-hybridation puis hybridation via sonde marquée.

- Sonde en excès éliminée de la membrane par différents lavages. Puis révélation (autoradiographie)

Northern Blot : même principe avec ARN mais ici électrophorèse en condition dénaturante (casse structure II car ARN déjà sous forme sb) => analyse expression d’un gène.

Dot et Slots Blot : transfère les acides nucléiques (ADN ou ARN) depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable. Le transfert par diffusion simple, par diffusion dans champs électrique ou par aspiration sous vide. La détection est similaire à celles utilisées dans les transferts avec séparation.

Hybridation sur colonie de bactérie, sur plage de lyse : boite avec banque de phages ou de bactéries -> réplicat sur filtre et dénaturation -> fixation + lavage -> hybridation avec sonde radio -> lavage et révélation par autoradiographie

Hybridation in situ

Hybridation sondes radioactives ou fluorescentes sur chromosomes en métaphase, tissus, organismes entiers

Puces à ADN

Les ARN totaux sont extraits pour comparer l'expression des gènes avec un étalon puis amplification. Ensuite ces ARNm sont transformés en ADNc et marqués par fluorochrome (vert ou rouge). On met ensuite les ADNc dans une puce contenant des fragments d'ADN, en même temps que l'ADNc étalon. Chaque point (ou spot) de la puce va être analysé individuellement par un scanner.

Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes

Partie 4 :

Amplification de fragment d’ADN par PCR

Principes de la PCR (bref rappel)

Cycle de PCR : dénaturation 94°, hybridation 55°, élongation 72° via taq

Pour clonage et analyse quantitative. Mix : ADN, 2 amorces, 4 dNTP, taq pol, tampon avec mg2+

Sensible, rapide et spécifique mais attention aux contaminations

PCR conventionnelle : analyse ADN en un point final sur gel

Quelques variantes de la PCR classiques

PCR spécifique d’un allèle et Rep-PCR pour identifier variants d’une souche

PCR temps réel

Analyse dynamique de la PCR quantitative. CT : seuil à partir duquel la phase exponentiel d’amplification débute (nombre de cycle nécessaire pour que la fluorescence atteigne un certain seuil).

Quantification via marquage non spécifique au SBYR Green I => agent intercalant (très fluo quand associé à un ADN db après polymérisation). Augmentation fluorescence mesurée pendant la polymérisation est proportionnelle au nombre de produits amplifiés.

Ou via sonde balise moléculaire : oligonucléotide en épingle à cheveux avec fluorochrome. Lecture fluorescence durant l’hybridation. La polymérisation retire la sonde qui reste intact.

Applications : quantification ADN, détection mutations ponctuelles, mise au point et amélioration amorces, diagnostiques, dosage OGM ou contaminent.

Séquençage d’ADN

Déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN donné.

Méthode enzymatique de Sanger

Polymérisation ADN initiée par une amorce complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par une ADN pol. 4 mélanges avec : Les quatre dNTPs sont ajoutés, ainsi qu’en faible concentration d’un des quatre didésoxyribonucléosides (ddNTPs avec H en 3’) marqués par des fluorochromes différents. Une fois incorporés à la nouvelle chaîne synthétisée ils empêchent la poursuite de l’élongation. Donne de nouveaux fragments d’ADN de tailles variables, qui sont ensuite séparés par électrophorèse. Lecture du bas 5’ vers le haut 3’ de l’électrophorèse donne la séquence complémentaire.

Variante avec marqueurs fluorescents et lecture au détecteur.

Pyroséquençage

Pas besoin de clonage. Ici, les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le Nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse et libère un Pyrophosphate (PPi). Une ATPsulfurylase vient alors le transformer ce en ATP qui est alors utilisé, couplé à une Luciférine, par une Luciférase. On a alors production d’Oxyluciférine et