Physiologie: Le milieu intérieur

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La concentration molaire en caséine est donc d'environ 4,19.10-4 mol/L

Pour trouver la concentration massique de caséine, nous avons Cmcaséine = C x Mcaséine, avec Mcaséine = 25000 g/mol. Soit :[pic 15]

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Séparation des acides aminés

Lorsque nous observons notre chromatographie (cf. annexe 2, illustration 2), nous pouvons apercevoir le front de migration. Le distance qu'a parcouru notre solvant depuis la ligne de dépôt est de 74mm. C'est grâce à celui-ci que nous pourrons calculer les rapport frontaux des acides aminés de référence (cf. annexe 2, tableau 3) ainsi que ceux des deux tripeptides sélectionnés présent dans les caséines (cf. annexe 2 tableau 4). Pour chacun d'eux nous observons trois tâches, une pour chaques acides aminés. Nous comparons ensuite les différents Rf calculés avec ceux des acides aminés de nature connue, nous permettant de déduire les acides aminés présents dans les tripeptides. Cependant le Rf n'est pas le seul critère qu'il faut prendre en compte pour déterminer la composition des tripeptides. En effet la couleur et la forme de la tâche joue aussi un rôle important surtout lorsque le Rf entre deux acides aminés est proche.

En ce qui concerne nos résultats qui nous donne la composition des tripetides en observant la chromatographie nous pouvons dire:

Pour les tâches représentantes de l'acide aminé inconnu 1 du tripeptide 1 et de l'acide aminé inconnu 6 du tripeptide 2, le Rf le plus proche est celui de l'alanine. Néanmoins lorsque nous comparons nos résultats avec ceux d'autres personnes nous observons que beaucoup ont trouvé un rapport frontal plus proche de celui de la Tyrosine. En effet cela est dû à leur Rf proche. Une confusion peut alors naître si la goutte posée au départ est positionnée différemment ou en plus grande quantité que celles des acide aminés de référence.

Ensuite si nous nous basions seulement sur les Rf sans prendre en compte les erreurs lors du dépôt des acides aminés et tripeptides; nous trouverions pour l'acide aminé inconnu 2 du tripeptide 1 une Tyrosine. Néanmoins de part sa structure particulière la Proline apparaît sous la forme d'une tâche de couleur jaune. Étant la seule à réagir de cette manière nous pouvons en conclure que l'acide aminé inconnu 2 est la Proline.

Pour finir pour l'acide aminé inconnu 3 du tripeptide 1, le Rf n'étant pas concluant (on trouve 0,5mm, ce qui se rapproche du Rf égal à 0,4mm pour l'Histidine et la Lysine), nous comparons alors la couleur de la tâche obtenue avec celles de la Lysine et l'Histidine. Nous remarquons que la Lysine y correspond plus.

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Matériel et Méthodes

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Séparation des caséines

On s'intéresse à une protéine particulière dans le lait, la caséine.

Notre but est de faire précipiter les caséines afin de pouvoir les séparer plus facilement des autres constituants. Pour cela nous allons utiliser le point isoélectrique. En effet en ce point toutes protéines possèdent une solubilité minimale dûe au fait qu'elles sont électriquement neutres. Il n'existe donc aucune force de répulsion entres elles ce qui permet leur agrégation. Le lait étant à pH neutre, il nous faut baisser le pH à environ 4,6. On ajoute alors 5mL d'acide acétique (quantité nécessaire pour atteindre le pHi des caséines) à 20mL de lait de vache entier. Après un temps de repos et une centrifugation nous pouvons enlever le surnageant.

Nous traitons ensuite le précipité obtenu à l'éthanol afin d'enlever l'eau restante. On utilise d'abord 10mL d'éthanol 70% de manière à éliminer les molécules d'eau en profondeur. Puis on répète l’expérience avec 10mL d'éthanol 95% pour sécher plus fortement le précipité de caséines. Entre chaque étapes on centrifuge et égoutte le précipité. Une fois ces opérations terminées on laisse sécher le précipité pour par la suite le peser afin de calculer son rendement.

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Détermination de la concentration des caséines

Nous cherchons maintenant à connaître la concentration de caséine dans le lait. Il faut pour cela quantifier la tyrosine libre obtenue par hydrolyse d'une solution de caséine purifiée. Nous devons alors faire un dosage colorimétrique des tyrosines.

Cette technique consiste à créer une gamme étalon (cf. annexe 1 tableau 2, tubes 1' à 6') à partir d'une gamme de concentration (cf. annexe 1 tableau 1) de tyrosine pure plus ou moins diluée dans de l'HCL 0,2mol/L ainsi que deux solutions dont nous souhaitons connaître la concentration massique en tyrosine libre (l'une de solution mère d'hydrolysât et l'autre dilué au ½ (cf. annexe 1 tableau 2, tubes 7' et 8')) auxquelles on ajoute une solution de NaOH 0,2mol/L, et le réactif de Folin Ciocalteu dilué au ½ . Celui ci développe une coloration bleue proportionnelle à la concentration de Tyrosine. On mesurera l'absorbance à 750nm de notre gamme étalon ainsi que celle des deux solutions de concentration inconnue au spectrophotomètre. Parmi la gamme étalon se trouve le tube témoin ( numéro 1') ne contenant pas de solution pure de Tyrosine libre afin de régler le spectrophotomètre avant de démarrer le dosage colorimétrique (cela permet d'annuler l'absorbance due aux réactifs eux-mêmes). Cette gamme nous permettra de tracer la courbe d'étalonnage (cf annexe 1 illustration 1) (vérifiant la loi de Beer Lambert: A = ε x l x C) à partir de laquelle nous pourrons déduire la concentration massique de tyrosine libre dans notre hydrolysât de caséines, afin de calculer la concentration massique des caséines en solution.

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Séparation des acides aminés

Nous allons à présent utiliser la technique de chromatographie de partage sur couche mince afin de déterminer la composition en acides aminés des tripeptides présents dans l'hydrolyse. La chromatographie sur couche mince est une méthode de séparation qui est basée sur les différences d'affinités des substances par rapport à deux phases dues à leurs