Etude des caséines bovines

...

[pic 2]

Figure 2 : chromatographe obtenu à l'issue de la CCM

Ces résultats sont approximatifs du fait d'une mauvaise manipulation et d'un manque de précision de la technique. Pour obtenir des résultats plus fiables, il nous faudrait réitérer l'expérience de manière plus rigoureuse et à l'aide d'un procédé optique. Malgré tout, les résultats restent cohérents : comme nous pouvions nous y attendre les acides aminés apolaires ont migré plus loin que les acides aminés hydrophiles de par l'utilisation d'un solvant, donc d'une phase mobile, hydrophobe.

Conclusion

Nous avons trouvé un rendement en caséines de 158% donc largement supérieur à à la quantité de caséines attendue, ainsi qu'une concentration massique en caséine de.8,5 g/L Notre étude de la composition en acides aminés de la caséine nous a révélé la présence des acides aminés lysine, proline, sérine, tryptophane et valine. Cependant, comme expliqué précédemment, de nombreuses erreurs se sont produites durant nos différentes manipulation, rendant nos résultats peu fiables. En effet, il y a potentiellement eu des erreurs lors de la précipitation des caséine, du séchage du culot de caséines, de la dilution des solutions de la gamme d'étalonnage et de la chromatographie de partage sur couche mince.

Les expériences n'ayant été réalisées qu'une seule fois, nous n'avons pas pu comparer différents résultats. Aux vues de la fiabilité plutôt médiocre de nos résultats, il nous faudrait réitérer les expériences soit avec les mêmes procédés, soit avec des procédés différents.

Afin de palier au manque de précision de la méthode utilisée pour la séparation des caséines nous aurions pu utiliser un autre procédé qui permet la séparation des protéines en fonction leur point isoélectrique, tel que l'électrofocalisation ou l'électrophorèse bidimensionnelle. Concernant le dosage colorimétrique seule une réitération de l'expérience pourrait nous permettre d'affirmer ou d'infirmer les résultats obtenus. La technique de chromatographie de partage sur couche mince présente une résolution faible, il serait donc nécessaire de refaire l'expérience avec une technique présentant une meilleure résolution telle que l'électrophorèse sur papier.

Matériels et méthodes

Séparation des caséines

Nous avons prélever lait auquel nous avons ajouté une solution d’acide acétique à 0,2 mol/L afin de diminuer le pH du lait à 4,6 et d’atteindre le pHi. Le point isoélectrique pHi est le pH auquel une molécule possède une charge globale neutre, ce qui permet la précipitation de cette molécule. On centrifuge le mélange à 4 000 tr/min afin d’accélérer l’agrégation, puis nous avons récupéré les caséines en éliminant le surnageant. Nous avons ajouté de l’éthanol à 70% puis de l’éthanol à 95% afin d’extraire le maximum d’eau des caséines. Nous avons récupéré le précipité de caséines et nous l’avons pesé après séchage.

Détermination de la concentration en caséines

Nous avons mélangé à des solutions de tyrosine pure allant de 0 à 50 mg/L de concentration massique en tyrosine, solubilisées dans une solution de chlorure d’hydrogène HCl à 0,2 mol/L, 2,5 ml de NaOH à 0,2 mol/L et 0,25 ml de réactif de Folin. Le réactif de Folin permet, en milieu alcalin et en présence de noyaux phénoliques tels que ceux des résidus de tyrosine libres, une coloration bleue de la solution et donc un dosage colorimétrique. Ces solutions servent de gamme d’étalonnage (cf. annexe 1). Nous avons réaliser le même mélange avec un hydrolysat de caséines solubilisé dans une solution de HCl à 0,2 mol/L et un hydrolat de caséines dilué au demi solubilisé dan une solution de HCl à 0,2 mol/L. Nous avons agité les solutions placées dans des cuves au vortex et, après 5 à 10 min, nous avons mesuré les absorbances des solutions à 750 nm au colorimètre, en se servant de la solution de tyrosine pure à 0 mg/L comme témoin.

Séparation des acides aminés

Pour libérer les acides aminés de tripeptides provenant de l’hydrolysat de caséines, nous avons utilisé le principe de la chromatographie de partage sur couche mince. La CCM est une méthode de séparation des acides aminés selon leur affinité pour la phase stationnaire ou pour la phase mobile qui dépend de la structure chimique de leur chaîne latérale. Nous avons déposé, sur une ligne de dépôt préalablement tracée à 2 cm d’un bord du film de cellulose, quelques μL de deux hydrolysats de tripeptides et de 14 solutions pures de différents acides aminés. Les dépôts sont séparés les uns des autres d’une distance d’environ 1 cm.

Nous avons laissé le film de cellulose dans une cuve contenant un mélange d’eau (1/6), d’acide acétique (1/6) et de butanol (4/6). Nous avons effectué la CCM sous vide et sous une hotte aspirante afin de, respectivement, accélérer la migration du solvant et limiter les risques liés à la toxicité et à l'inflammabilité du solvant. Nous avons retiré le film de cellulose de la cuve lorsque la phase mobile a atteint les 3/4 du film et nous l'avons laissé sécher sous la hotte.

Abréviations

A = absorbance ml = millilitre

C = concentration molaire mol = mole

Cm = concentration massique NaOH = hydroxyde de sodium

cm = centimètre nm = nanomètre

CCM = chromatographie sur couche mince pHi = point isoélectrique

HCl = chlorure d'hydrogène Rf = rapport frontal

L = litre tr = tour

M = masse molaire μL = microlitre

mg = milligramme % = pour cent

min = minute

Annexes

Tube 1

Tube 2

Tube 3

Tube 4

Tube 5

Tube