Techniques de génotypage

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2 - Analyse par polymorphisme de restriction(RFLP) :

L’analyse par polymorphisme de restriction (restriction fragment length polymorphism : RFLP) repose sur la différence de taille d’amplicons du gène S après digestion enzymatique. Une étude a comparé les séquences du gène S et a identifié des sites de restriction spécifiques de chaque génotype. Après une étape d’amplification, les séquences sont digérées par plusieurs endonucléases (HphI, NciI, AlwI, EarI et NlaIV) et les fragments obtenus sont séparés par électrophorèse. La taille des différents fragments est caractéristique de chaque génotype. Toute mutation portant sur la région analysée peut entraîner la suppression ou la création d’un site de restriction et fausser les résultats du génotypage.

3 - Utilisation d’amorces spécifiques de type :

La méthode développée par Naito et al. repose sur l’existence d’une divergence intergroupe de la séquence nucléotidique au niveau d’une région conservée des gènes préS1/S. L’ADN duVHB est amplifié par PCR nichée : alors que les amorces utilisées lors de la première PCR permettent l’amplification de tous les génotypes de A à H, les amorces de la seconde PCR sont spécifiques de chacun. L’identification des génotypes est fondée sur la différence de taille des amplicons. Kirschberg et al. ont développé une PCR multiplex, qui permet d’amplifier spécifiquement chacun des huit génotypes en une seule étape.

4 - Hybridation sur support solide :

Des techniques d’hybridation à l’aide de sondes spécifiques sur bandelettes de nitrocellulose ou récemment, en microplaque sont des méthodes rapides, standardisées : le test INNO-LIPA HBV Genotyping différencie les génotypes A à F, et la trousse Smitest HBV genotype detection identifie les génotypes A à G.

Dans un premier temps, l’ADN du VHB est amplifié par PCR dans la région préS1. Ensuite, les produits de PCR sont mis en contact avec des sondes marquées, spécifiques de chaque génotype, fixées sur des bandelettes de nitrocellulose (LiPA) ou au fond des puits d’une microplaque (GSPA). Le résultat de l’hybridation est révélé par réaction colorimétrique.

5 - Tests sérologiques :

Des techniques sérologiques permettent également de sérotyper le VHB avec une certaine concordance avec le génotypage. Un panel d’anticorps monoclonaux dirigés contre sept épitopes de la région préS2 permet de différencier les génotypes selon leurs réactivités antigéniques. Les protéines préS2 fixées au fond des puits d’une microplaque sont testées avec les anticorps monoclonaux marqués, chaque génotype est caractérisé par une combinaison différente d’épitopes.