Les techniques générales de génétique moléculaire

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- Dot Blot

Lors d’un dot blot, les acides nucléiques (ADN ou ARN) ou des protéines sont transférées depuis un milieu liquide directement sur une membrane, sans séparation préalable

- Hybridation in situ

Cette technique consiste à réaliser l’hybridation directement sur des coupes histologiques ou sur un étalement de chromosomes.

- Puces à ADN

Les puces à ADN permettent de mesurer et de visualiser très rapidement les différences d'expression entre les gènes et ceci à l'échelle d'un génome complet

- Western Blot

Après dénaturation, les protéines (antigènes) sont séparées en fonction de leur taille par électrophorèse puis transférées depuis le gel sur une membrane (souvent en nitrocellulose), où elles sont ensuite exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.

- 1e étape : dénaturation des protéines

- 2e étape : Electrophorèse SDS PAGE → séparation des protéines en fonction de leur taille

- 3e étape : transfert des protéines sur une membrane

- 4e étape : saturation de la membrane pour éviter liaisons non spécifiques des anticorps

- 5e étape : ajout anticorps (généralement en 2 étapes)

- 6e étape : révélation → incubation dans une solution de détection

- 7e étape : analyse des résultats

- Les enzymes de restriction

Le phénomène de restriction résulte de la présence dans une même bactérie de deux types d'activités enzymatiques:

- une ou plusieurs activité(s) endonucléase(s) → enzyme(s) de restriction

- une ou plusieurs activité(s) de modification, le plus souvent trans-méthylase(s) (que nous nommerons méthylase(s))

Il existe trois types d'enzyme de restriction mais seule l'enzyme de restriction de type II est utilisée en laboratoire en routine.

L'enzyme de type II peut provoquer différentes coupures :

- coupures à bouts francs : l'enzyme coupe exactement au même niveau sur les deux brins d'ADN

- coupures décalées ou à bouts cohésifs : coupures décalées d'un brin à l'autre

- Détermination de la séquence d'ADN

Le séquençage de l'ADN consiste à déterminer l'enchaînement des nucléotides qui le constitue (si l’on exclue les méthylations)

- Méthode de Sanger

La méthode est fondée sur une synthèse enzymatique d'un brin d’ADN complémentaire à un brin matrice (= l'échantillon à séquencer). Une ADN polymérase complète la chaîne de nucléotides à partir d'une amorce, en recopiant fidèlement la matrice de l'ADN simple-brin. En amont du site de clonage multiple se trouve une région sur laquelle pourra s'hybrider une amorce synthétique. Cet oligonucléotide de synthèse complémentaire d'une région de la matrice servira d'amorce pour la synthèse du second brin d'ADN.

- Techniques d'amplification

- PCR : Polymerisation Chain Reaction

PCR permet d'amplifier séquence ADN sans avoir à la cloner.

- 1e étape : dénaturation de la double hélice d'ADN cible par la chaleur (destruction des liaisons H)

- 2e étape : appariement des amorces (hybridation) sur les régions complémentaires

- 3e étape : polymérisation → la polymérase allonge les nouveaux brins d’ADN à partir des amorces, en assemblant des nucléotides triphosphates

Il y a un cycle d'amplification : un seul fragment de matrice au départ → 2 nouvelles copies