Extraction et purification de l'ADN

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Composants de l’électrophorèse sur gel d’agarose

Agarose

L’agarose, un colloïde naturel extrait d’une algue, est un polysaccharide linéaire (masse moléculaire moyenne : ~12 000 Da) composé de l’unité de répétition fondamentale agarobiose, elle-même composée d’unités alternantes de galactose et de 3,6-anhydrogalactose. L’agarose est très fragile et se détruit facilement sous l’effet de manipulations. Les gels d’agarose ont de grands « pores » et sont utilisés essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse moléculaire supérieure à 200 kDa.

Les gels d’agarose sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension dans un tampon aqueux, puis en faisant bouillir le mélange jusqu’à ce que l’agarose se transforme en une solution claire. Celle-ci est ensuite versée sur un moule et mise à refroidir à température ambiante jusqu’à formation d’un gel rigide. En durcissant, l’agarose forme une matrice dont la densité est déterminée par sa concentration.

Tampon d’électrophorèse

Il existe plusieurs tampons pour l’électrophorèse de l’ADN natif double brins. Ces tampons contiennent de l’EDTA (pH 8,0) et du tris-acétate (TAE), du tris-borate (TBE) ou du tris-phosphate (TPE) à une concentration avoisinant les 50 mM (pH 7,57, 8). Les tampons d’électrophorèse sont généralement préparés sous forme de solutions concentrées et conservés à température ambiante. Le TBE a été utilisé initialement à une force de travail d’1x pour l’électrophorèse sur gel d’agarose. Une solution fonctionnelle de 0,5x a toutefois déjà un pouvoir tampon plus que suffisant et la quasi-totalité des électrophorèses sur gel d’agarose sont désormais exécutées en utilisant cette concentration tampon. Concentration d’agarose

Un fragment d’ADN d’une taille donnée migre à travers des gels à différents taux en fonction de la concentration d’agarose. En fonction de la concentration spécifique de l’agarose ou du tampon, des segments d’ADN contenant entre 20 et 50 000 bp peuvent être séparés. Dans les gels horizontaux, l’agarose est généralement utilisé à des concentrations comprises entre 0,7% et 3%.

ADN marqueur

La distance de migration, pour une tension, un gel d’agarose et des concentrations de tampon donnés, dépend du poids moléculaire du matériau de départ. Les puits situés à gauche et à droite du gel devraient, dès lors, être remplis avec un ADN marqueur d’une taille connue. Un marqueur contient généralement un nombre défini de fragments d’ADN connus, ce qui permet de déterminer plus facilement la taille des ADN inconnus si une distorsion systématique du gel devait se produire en cours d’électrophorèse.

Tampon de charge

Les échantillons d’ADN à charger sur le gel d’agarose sont tout d’abord mélangés à un tampon de charge composé généralement d’eau, de saccharose et d’une teinture (par exemple, du xylène cyanol, du bleu de bromophénol, du vert de bromocrésol, etc.).

Le tampon de chargement a un triple objectif :

- Il augmente la densité de l’échantillon en faisant en sorte que les gouttes d’ADN tombent de façon harmonieuse dans le puits ;

- Il ajoute de la couleur à l’échantillon, simplifiant ainsi le processus de chargement ;

- Il attribue une teinture à l’échantillon qui, dans un champ électrique, évolue vers l’anode à une vitesse prévisible.