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Techniques de Biologie Moléculaire appliquée à la Médecine

Par   •  26 Mars 2018  •  1 565 Mots (7 Pages)  •  154 Vues

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La mutation la plus fréquente fait 70 % de la population mondiale : ΔF508.

Elle entraîne une délétion de 3 bases (phenylalanine) en position 508 de l’exon 10 du gène.

- Clinique

Pathologie des secrétions exocrines

Epithelium respiratoire :

- Obstruction des voies respiratoires par secrétions muqueuses.

- Surinfection (Pseudomonas aeruginosa).

- Insuffisance respiratoire.

Epithélium digestif :

- Insuffisance pancréatique.

- Iléus méconial à révélation anté- ou néonatale.

- Stratégie Diagnostique

On ne va pas étudier les 600 mutations, on va faire des choix :

[pic 5]

- Technique OLA

OLA = Oligonucleotide Ligation Assay

Détection de 33 mutations:

S549N, S549R , R553X, G551D, V520F , DI507 , DF508 , Q493X, 1717-1(G/A), G542X, R560T, R347P, R347H, 3849+4(A/G) , W1282X, R334W, 1078delT, 3849+10 kb, R1162X, N1303K, 3659delC, 3905insT, A455E, R117H, Y122X, 2184(AA/G), 2789+5(G/A), 1898+1(G/A), 621+1(G/T), 711+1(G/T), G85E)

Le taux de couverture de la population d’île de France est de 80%

Principe de la technique OLA :

Cette technique marche avec 3 types de sens :

- Sondes mutantes qui détectent des mutations.

- Sondes normales qui reconnaissent l’ADN normal.

- Sondes communes qui sont situées sur un endroit normal et qui porte un fluorochrome.

[pic 6]

Protocole Opératoire

- PCR multiplex

On fait l’amplification de 11 séquences exoniques et 6 séquences introniques du gène CFTR par 15 paires d’amorces.

- Hybridation

Cchaque région amplifiée est hybridée avec 3 sondes distinctes :

*Les sondes « communes » : s’hybrident à la fois sur le brin normal et le brin muté marquées par un fluorophore FAM, TET ou HEX.

*Les sondes « mutées » et « normales » qui entrent en compétition pour se fixer sur le brin complémentaire.

- Ligation sonde « commune »/ sondes « mutée » ou « normale »

On fait la ligation des sondes spécifiques d’allèle hybridées avec la sonde « commune » elle-même fixée sur sa séquence spécifique par addition de T4 DNA Ligase

On forme ainsi un produit OLA.

- Analyse des produits OLA

Séparation par électrophorèse capillaire en gel de polyacrylamide 6% sur séquenceur automatique en fonction de la taille

Interprétation

Identification du produit OLA formé par les logiciels d’analyse en fonction de la taille et de la « couleur » du fluorophore

Electrophoregramme:

Absence de mutation :

11 pics bleus , 10 pics verts et 10 pics noirs clairement identifiés

Présence d’une mutation à l’état hétérozygote:

pic supplémentaire dans une des trois couleurs identifié en rouge

Présence d’une mutation à l’état homozygote:

nombre de pics inchangé mais taille légèrement différente

Profile OLA de patient normal

On a 11 pics bleus , 10 pics verts et 10 pics noirs clairement identifiés.

[pic 7]

Profil OLA de patient hétérozygote F508del

On identifie un pic supplémentaire dans une des trois couleurs identifié en rouge.

[pic 8]

Profil OLA d’un patient hétérozygote composite F508del/S549R

[pic 9]

Il faut confirmer le diagnostic, on le fait par PCR.

Confirmation de la mutation delta F508 par PCR

Mutation delta F508= délétion de 3 bases. On fait la PCR de l’exon 10.

On fait des étapes de dénaturation-renaturation, et migration sur un gel de polyacrylamide non dénaturant.

Visualisation sur gel:

- Sujets homozygotes : appariement entre amplimères mutés ou normaux sous forme unique : Homoduplex.

- Sujets hétérozygotes : appariement avec mismatch entre un amplimère muté et un amplimère normal : Homoduplex et hétéroduplex.

- Dystrophie Myotonique de Steinert

- Physiopathologie

Fréquence: 1/8000

Transmission: autosomique dominant avec phénomène d’anticipation (Au fur et à mesure des génération, la mutation augmente).

Anomalie Moléculaire:

K 19 q 13.2-13.9

Répétition de –(CTG)n dans la séquence 3’ non traduite du gène DMP.

- 5 normale.

- 36 intermédiaire → Transmission à l’enfant qui sera atteint.

-

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