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TP sur l'enzymologie.

Par   •  3 Juin 2018  •  2 360 Mots (10 Pages)  •  186 Vues

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...

Les fractions choisies et leurs vitesses de réactions sont :

Mesure 1 : 0.093/2 = 0.0465 min-1

Mesure 2 : 0.095/2 = 0.0475 min-1

Mesure 3 : 0.151/2 = 0.075 min-1

Mesure 4 : 0.038/2 = 0.019 min-1

Mesure 5 : 0.006/2 = 3.10-3 min-1

Mesure 6 : 0.022/2 = 0.011 min-1

Ce sont celles qui ont les concentrations de chymotrypsine les plus élevées. Ces deux éluat seront mélangés dans un tube et constitueront notre pool de chymotrypsine. Ce sont donc les mesures 2 et 3. On mesure l’activité du pool grâce au spectrophotomètre, et son absorbance est de 0.435. On peut donc calculer la concentration du pool (voir partie IV. Résultats). Le gel est ensuite régénéré en éluant la trypsine avec 10mL de solution d’élution de la trypsine puis Rééquilibrer avec 10mL de Tampon d’élution du chymotrypsinogène.

- Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme

• En absence d'inhibiteur

Dans cette expérience, on fait varier la concentration du substrat de 0,02 mM à 0,2mM en faisant varier le volume de substrat (S) utilisé. Le volume final réactionnel doit être de 3mL.

Essai

Vol tampon (ml)

Vol DMSO (ml)

Vol substrat (ml)

Vol chymotrypsine (µl)

1/[S]

[S]

V (ΔA/min)

1

3

0.27

0.03

10

50

0.02

5.10-3

2

3

0.261

0.039

10

38.75

0.026

7.10-3

3

3

0.246

0.054

10

27.5

0.036

9.10-3

4

3

0.207

0.093

10

16.25

0.062

12.10-3

5

3

0

0.3

10

5

0.2

6.10-3

Pour les 5 essais, on prépare le milieu réactionnel dans la cuve comme indiqué ci-dessus, on fait l’étalonnage de l’appareil puis on ajoute l’enzyme en dernier. La cinétique d’hydrolyse du substrat se fera sur 2 minutes.

• En présence d'inhibiteur

Dans cette expérience, on utilise la même gamme de concentration de substrat (volume) en présence d’un volume fixe, 50 μL d’aprotinine. Le volume final réactionnel est toujours de 3Ml.

Essai

Vol tampon (ml)

Vol DMSO (ml)

Vol substrat (ml)

Vol inhibiteur (ml)

Vol chymotrypsine (µl)

1/[S]

[S] (mM)

V (ΔA/min)

1

3

0.27

0.03

0.05

10

50

0.02

4.10-3

2

3

0.261

0.039

0.05

10

38.75

0.026

4.10-3

3

3

0.246

0.054

0.05

10

27.5

0.036

5.10-3

4

3

0.207

0.093

0.05

10

16.25

0.062

9.10-3

5

3

0

0.3

0.05

10

...

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